CRISPR) üçünji nesil genom redaktirleme usulydyr: CRISPR dünýäde rewolýusiýa döretdi

Klasterleşdirilen yzygiderli aralykly gysga palindromik gaýtalamalar (CRISPR), ýokary öndürijilikli netijeleri bilen dünýäde rewolýusiýa döreden üçünji nesil genom redaktirleme usulydyr. Ol dürli biologik keselleri we infeksiýalary bejermek üçin ulanyldy. Dürli bakteriýalar we beýleki prokariotlar (meselem, arheýalar) hem faglardan goranmak üçin CRISPR/Cas9 ulgamlaryna eýedirler. CRISPR/Cas9 esasly strategiýalaryň mümkin bolan üýtgedilen garşylyk genlerini, transkripsiýany we epigenetiki düzgünleşdirmäni nyşana almak arkaly üçlü negatiw döş rakynyň (TNBC) ösüşini we ösüşini togtadyp biljekdigi habar berildi. Bu terapewtiki çäreler hatda TNBC-de hem syn edilýän derman garşylygy ýaly kyn meseleleri çözmäge kömek edip biler. Häzirki wagtda CRISPR/Cas9-y nyşana öýjüklere ýetirmek üçin dürli usullar ulanylýar, mysal üçin fiziki (mikroinýeksiýa, elektroporasiýa we gidrodinamik usullar), wirusly (adeno bilen baglanyşykly wirus we lentiwirus) we wirus däl (liposomalar we lipid nanopartikullary). )-partikullar). TNBC-niň molekulýar sebäplerini öwrenmek üçin dürli modeller işlenip düzülse-de, genom redaktirleme gurallaryny in vivo hödürlemek üçin duýgur we maksada gönükdirilen usullaryň ýoklugy olaryň kliniki ulanylyşyny çäklendirýär. Gysgaça aýdylanda, bu syny bar bolan subutnamalara esaslanyp, TNBC üçin CRISPR/Cas9 bejergisiniň ösüşini, kynçylyklaryny, çäklendirmelerini we mümkinçiliklerini hemmetaraplaýyn öwrenýär. Şeýle hem, süni intellektiň we maşyn öwrenmeginiň utgaşdyrylmagynyň TNBC-ni bejermekde CRISPR/Cas9 strategiýalaryny nähili gowulandyryp biljekdigini nygtaýarys.
Rak keseli gözegçiliksiz öýjük bölünişi, öýjük sikliniň gözegçilik nokatlarynyň bozulmagy we şiş basyjy genlerinde (TSG) mutasiýalar bilen häsiýetlendirilýär (Matthews we başg., 2022). Rak keseliniň dürli görnüşleriniň arasynda süýt mäziniň rak keseli aýallarda iň köp ýaýran rak keseliniň görnüşi bolup, dünýäde ölüm derejesi ýokarydyr (Waks we Winer, 2019). Süýt mäziniň rak keseli gistologiki we biologiki aýratynlyklary, kliniki görnüşi we özüni alyp barşy, şeýle hem bejergä bolan jogaby ýaly dürli häsiýetlere eýe bolan dürli keseldir (Weigelt we başg., 2010). Süýt mäziniň klassifikasiýasy süýt mäziniň diagnozy we şişiň prognozy üçin takyk düşünjeleri berýär. Umumy biomarkerleriň we kliniki patologiki aýratynlyklaryň ulanylmagy süýt mäziniň rak keseliniň klassifikasiýasynyň esasy kriteriýalary boldy (Tsang we Tse, 2019). Süýt mäziniň prognozy we bejergä bolan jogabyna estrogen reseptorynyň (ER), progesteron reseptorynyň (PR), adam epidermal ösüş faktory reseptory 2-niň (HER2/neu) bolmagy we gistologiki dereje, şişiň görnüşi we derejesi ýaly köp sanly faktorlar täsir edýär. ululygy we limfa düwünleriniň metastazy (Al-Tubaiti, 2020). Süýt mäziniň rak keseliniň bäş içki molekulýar görnüşi anyklanyldy, şol sanda lüminal A, lüminal B, HER2 bilen baýlaşdyrylan, bazal görnüşli we klaudin-pes (Prat we başg., 2015). TNBC ähli ER, PR we HER2-ni görkezmeýän rak keseliniň molekulýar görnüşidir (Yin we başg., 2020). Bu patologiki aýratynlyklar TNBC bilen baglanyşyklydyr, bu onuň çalt ösüşini we beýleki islendik süýt mäziniň rak görnüşine garanyňda has agressiw tebigatyny tassyklaýar (Feng we başg., 2018). Mundan başga-da, Peru we başg. (2000) süýt mäziniň rak keselini täzeden klassifikasiýa etmek we süýt mäziniň rak keseliniň bäş içki görnüşini kesgitlemek üçin mikroarray tehnologiýasyny ulandylar (Cadenas, 2012). Bazal görnüşli süýt mäziniň rak keseli üçlü negatiw fenotipe eýe bolan we çalt ösüşi bilen baglanyşykly süýt mäziniň rak keseliniň bir görnüşidir. Belläp geçmeli zat, ähli bazal görnüşli süýt rak keselleriniň köplenç ýalňyşlyk bilen TNBC diýlip diagnoz goýulýar, ýöne diňe 77% -i TNBC; Tersine, TNBC-niň 71–91% -i bazal görnüşlidir, bu bolsa süýt rakynyň bu iki görnüşiniň gabat gelýändigini we dürli klassifikasiýalary aňladýandygyny görkezýär (Wang D.-Y. we başg., 2019). Bu bolsa, prognozy aýdyňlaşdyrmak we häzirki we geljekki bejergilere mümkin bolan jogaplary kesgitlemek üçin TNBC-niň heterojenligini häsiýetlendirmek zerurlygyny döredýär. Mundan başga-da, TNBC süýt rakynyň ähli ýagdaýlarynyň 15–20% -ini düzýär we 50 ýaşdan kiçi aýallarda has köp duş gelýär. BRCA1 ýa-da BRCA2 mutasiýalary TNBC ýagdaýlarynyň takmynan 20% -inde habar berildi (Xie we başg., 2017; Tzikas we başg., 2017). , 2020). Şeýle hem, barlaglar TNBC-niň damar endotelial ösüş faktorlarynyň, şiş bilen baglanyşykly makrofaglaryň (TAM), şişe infiltrasiýa edýän limfositleriň (TIL) we şişiň ösmegine we göçmegine gatnaşýan beýleki molekulalaryň ýokary derejesini öz içine alýan aýratyn immun mikro gurşawyna eýedigini görkezdi. Şonuň üçin TNBC-niň mikro gurşawyny düşünmek onuň prognozy we bejergisi üçin örän möhümdir (Fan we He, 2022).
TNBC-niň prognozyny bahalandyrmak we netijeli bejergini üpjün etmek üçin, esasan ER, PR we HER2-ni anyklamak üçin immunogistohimiýa (IHC) we süýt neoplazmalaryny anyklamak üçin mammografiýa esaslanyp, takyk diagnoz goýmak möhümdir. Şeýle-de bolsa, mammografiýa nekroz we fibroz ýaly şiş içindäki aýratynlyklary ýeterlik derejede görkezip bilmeýär (Deepak Singh we başg., 2021). Prognozyň we diagnozyň ýaramaz bolmagy lukmanlara dogry dermanlary bellemäge päsgel berýändigi sebäpli (Chaudhary, 2020), TNBC-li näsaglara bejergini gowulandyrmak üçin dürli strategiýalar ulanylýar. Häzirki wagtda TNBC-li näsaglarda iki derman, doksorubisin we siklofosfamid ulanylýar we gowy netijeleri görkezdi. Mundan başga-da, karboplatin we sisplatin ýaly beýleki platina dermanlary ulanylýar (Sikov we başg., 2015). Mundan başga-da, Olaparib, Velaparib we PF-01367338 ýaly PARP ingibitorlary TNBC-ni bejermek üçin potensial himioterapiýa dermanlary hökmünde ulanyldy (Ishino we başg., 2018). Wnt/b-Catenin, NOTCH we Hedgehog signal ýollarynyň TNBC-niň ýüze çykmagyna we ösmegine gatnaşýandygy habar berlendigi sebäpli, bu ýollara derman serişdelerini gönükdirmek möhüm strategiýa bolup biler (Aysola we beýlekiler, 2013). Häzirki wagtda hirurgiýa, şöhle terapiýasy we himioterapiýa TNBC-niň bejergisiniň esasy usuly bolmagynda galsa-da, maksatly terapiýa, immunoterapiýa, Cas9n, dCas9 ýaly dürli CRISPR bilen baglanyşykly gen redaktirleme gurallary, CRISPR/Cas12, esasy redaktirleme we CRISPR/Cas9-u maksatly gen terapiýasy ýaly täze bejergileri işläp düzmekde uly ösüş gazanyldy. Bu ýerde biz TNBC-ni bejermekde ulanylýan dürli CRISPR bilen baglanyşykly gen redaktirleme gurallaryna üns bereris. Olaryň arasynda CRISPR/Cas9 giňden üns çekdi.
Cas9n, Cas9 nikaza diýlip hem atlandyrylýar, CRISPR/Cas9 genom redaktirleme ulgamyndan alynýan Cas9 belogynyň genetiki taýdan işlenen görnüşidir (Gupta we beýlekiler, 2019). Asyl görnüşinde Cas9 belogy iki nukleaza domenini öz içine alýar: RuvC we HNH, olaryň esasy funksiýasy iki DNK zynjyrynyň bölünmegidir. Şeýle-de bolsa, Cas9n-da nukleaza domenleriniň biri bolan HNH genetiki taýdan mutasiýa geçýär we işjeň däl bolýar. Şonuň üçin Cas9n-yň HNH domeni işlemeýänligine galýar. Diňe RuvC domeni işjeňligine galýar, bu bolsa Cas9n-a ýeke DNK zynjyrlarynda kesmäge ýa-da arakesme döretmäge mümkinçilik berýär (Trevino we Zhang, 2014). Cas9 bilen deňeşdirilende, Cas9n nyşanadan daşary täsirleri netijeli azaldyp we öýjükleriň abatlaýyş mehanizmlerini takyk gowulandyryp biler. Cas9n iki zynjyrly DNK-da belli bir ýerlerde arakesme döretmek ýaly dürli meseleleri çözmek üçin ulanylyp bilner. Şu maksat bilen iki Cas9n molekulasy birleşdirilip, bilelikde ulanyldy (Yee, 2016). Gatyşyk nesil kinaza 3 (MLK3) TNBC metastaz wagtynda esasy düzgünleşdiriji bolup hyzmat edýän mitogen tarapyndan aktiwleşdirilen belok kinazasydyr (Cronan we beýlekiler, 2012).
MLK3 TNBC metastazyna getirýän köp sanly signal ýollaryny işjeňleşdirip bilýär. Mysal üçin, c-Jun N-terminal kinaza (JNK) ýoly öýjük hereketliligini we öýjükden daşary matrisanyň dargamagyny düzgünleşdirýär, MLK3 bolsa JNK ýoluny işjeňleşdirýär, şeýdip öýjük hereketliligini güýçlendirýär we inwaziw häsiýetleri berýär (Rattanasinchai we Gallo, 2016). MLK3 şeýle hem EMT-ni düzgünleşdirýär. Munuň üçin ol Snail, Slug we Twist ýaly aşaky transkripsiýa faktorlaryny işjeňleşdirýär. Bu faktorlar epitelial markerleriň ekspresiýasyny bökdeýär we mezenhimal markerleriň ekspresiýasyny höweslendirýär, bu bolsa metastatik fenotipiň gazanylmagyna getirýär (Casalino we başg., 2023). MLK3-iň ECM-iň täzeden gurulmagynda we ECM-i dargadýan matrisa metalloproteinazalary (MMP) ýaly proteazalaryň aktiwleşdirilmeginde rol oýnaýandygy syn edildi. Bu bolsa şiş öýjükleriniň çozuşyny we uzak ýerlere ýaýramagyny ýeňilleşdirýär (Katari we başg., 2019). Şeýlelik bilen, öňki barlaglar MLK3-iň TNBC-de möhüm rol oýnaýandygyny görkezdi. Rattanasinchai we Gallo MLK3-iň roluny öwrenmek üçin TNBC modellerini ulandylar we onuň belli bir signal ýollary arkaly rak keseliniň ösmegine itergi berýändigini anykladylar. Olar MLK3-i redaktirlemek üçin CRISPR/Cas9n ulandylar we TNBC metastazynyň ep-esli azalandygyny gördüler (Rattanasinchai we Gallo, 2016).
dCas9, köplenç işjeň däl Cas9 diýlip atlandyrylýar, Cas9 belogynyň üýtgedilen türew görnüşidir. Aktiw Cas9-dan tapawutlylykda, dCas9 endonukleaza işjeňligine eýe däl, bu bolsa DNK-nyň iki zynjyrly bölünişlerini döredip bilmeýär. Şonuň üçin dCas9 genomun belli bir sebitlerini DNK yzygiderliginde hiç hili üýtgeşme ýa-da modifikasiýa bolmazdan takyk nyşana almak üçin ulanylyp bilner (Wang we beýlekiler, 2016). dCas9-da iki endonukleaza belogy, RuvC we HNH, möhüm aminokislota galyndylaryny basyp ýatyrmak arkaly işjeňsizleşdirilýär. (Richter we beýlekiler, 2016). DNK bölüniş işjeňliginiň ýoklugyna garamazdan, dCas9 genetiki barlaglarda we biotehnologiýada birnäçe möhüm rol oýnaýar. Mysal üçin, ol genomun belli bir sebitlerini görselleşdirmäge mümkinçilik berýär, transkripsiýa düzgünleşdirmesini ýeňilleşdirýär we epigenetiki üýtgeşmeleri höweslendirýär (Brocken we beýlekiler, 2018).
Transkripsiýa faktory ZEB1 (sink barmakly E-gutujygy birleşdirýän homeoboks 1) epitelial-mezenhimal geçişi (EMT), embrional ösüş, dokumalaryň dikeldilmegi we rak keseliniň ösmegi döwründe bolup geçýän öýjük prosesini amala aşyrmakda aýratyn we möhüm rol oýnaýar. Ol epitelial öýjükleriň mezenhimal öýjüklere öwrülmegini öz içine alýar we öýjük morfologiýasynda, hereketliliginde, inwaziwliginde we ş.m. üýtgeşmelere getirýär (Wu we başg., 2020). ZEB1 TNBC-de epitelial öýjükleriň öýjük-öýjük ýapyşmagyny we polýarlygyny saklamak üçin jogapkär bolan E-kadherin we Okkludin ýaly köp sanly epitelial markerleriň öňüni alýar (Moreno-Bueno we başg., 2008). Mundan başga-da, ZEB1 N-kadherin, wimentin we fibronektin ýaly käbir markerleri işjeňleşdirýär (Konradi we başg., 2014), şeýle hem Rho GTPazalary we matrisa metalloproteinazalary (MMPs) ýaly sitoskelet täzeden gurulmagyna gatnaşýan genleri düzgünleşdirýär (Huang). we başg., 2014). 2022), mundan başga-da, ol dürli signal ýollaryna, meselem, ösüş faktory-β (TGF-β), Wnt signallaşdyrmasy we ş.m. täsir edýär, şeýdip TNBC-de şişiň ýaýramagyna we metastazyna itergi berýär (Chen we başg., 2016). Köp sanly barlaglar we ylmy subutnamalar ZEB1-iň TNBC-ni anyklamak we bejeriş üçin gymmatly serişde hökmünde uly mümkinçilikleriň bardygyny görkezýär. Ýakynda geçirilen bir barlagda Waryah we başg. TNBC modelini ulandylar we dCas9 tarapyndan ZEB1-iň doly basylyp ýatyrylmagyna ýetdiler. Şeýlelik bilen, olar in vivo şertlerinde ZEB1-iň örän ýokary spesifikasiýasyny we diýen ýaly doly basylyp ýatyrylmagyny synladylar (Waryah we başg., 2023).
CRISPR/Cas12, CRISPR/Cpf1 atly gen redaktirleme guralydyr. Ol CRISPR/Cas ulgamyndan gelip çykýar, bu ýerde Cas12 termini Cas9-a düýbünden meňzeş bolan CRISPR bilen baglanyşykly 12 belokyny aňladýar (Bharathkumar we başg., 2022). Ýeke-täk tapawut, onuň Cas12 belogyny öz içine almagydyr. Cas9 bilen deňeşdirilende, Cas12 gen redaktirleme prosesinde ýapyşyk uçlary döretmek ýaly käbir özboluşly funksiýalara eýedir, Cas9 bolsa küt uçlary döredýär (Wang we başg., 2021). Cas12-niň bu häsiýeti onuň DNK manipulýasiýa tehnologiýasyna goşant goşýar. Nyşana DNK-ny takyk tanamaga we kesmäge ukyply belok hökmünde, ol adatdan daşary köpugurlylyga eýedir, bu bolsa ony gen redaktirlemesi ýaly dürli ulanylyşlar üçin netijeli gurala öwürýär (Pickar-Oliver we Gersbach, 2019).
Beýleki CRISPR görnüşlerine meňzeş, CRISPR/Cas12 hem TNBC-däki genleri ýok edip ýa-da işjeňleşdirip, onuň patogenezinde ýa-da bejergä jogabynda möhüm rol oýnaýan genleri nyşana alyp bilýär (Ýang we Zhang, 2023). Bu prosesi amala aşyrmak üçin Cas12-ni maksatly gene gönükdirýän ýol görkeziji RNK (gRNK) işlenip düzüldi. Cas12 öz maksadyna baglanandan soň, DNK-da iki zynjyrly arakesmeleri girizýär we DNK-ny dikeltmek mehanizmlerini işjeňleşdirýär. Düzeldiş prosesinde nädogry nukleotidler goşulyp, gen mutasiýalaryna we funksiýanyň ýitmegine sebäp bolup biler (Zhang we başg., 2021a). Mundan başga-da, genleri işjeňleşdirmek üçin Cas12 fermentiniň gowulandyrylan görnüşi (dCas12 diýlip atlandyrylýar) hem ulanyldy. Ony transkripsiýa aktiwatory bilen utgaşdyrmak arkaly käbir genleri döredip, şeýlelik bilen olary işjeňleşdirmek mümkin. Bu tehnologiýanyň şiş basyjy genleriniň işjeňleşdirilmegini höweslendirmekde uly mümkinçilikleri bar (Sultan we başg., 2022).
Esasy redaktirleme täze işlenip düzülen we örän ýokary derejeli genom redaktirleme tehnologiýasydyr. Ol organizmiň DNK-syny örän takyk üýtgetmäge ukyplydyr (Chen we Liu, 2023). Esasy redaktirleme iki esasy komponentiň integrasiýasy arkaly amala aşyrylýar: üýtgedilen CRISPR/Cas9 fermenti we ters transkriptaza. CRISPR/Cas9 fermentiniň roly genomdaky takyk ýerleri saýlama nyşana almakdyr, ters transkriptaza bolsa maksatly ýerde DNK-ny düýpli üýtgetmäge kömek edýär (Hassan we başg., 2021). Esasy redaktirleme mehanizminde ilkinji ädim esasy redaktirleme gollanmasy RNK-ny (pegRNA) döretmegi öz içine alýar (Standage-Beier we başg., 2021). Ol maksatly DNK-daky islenýän redaktirleme ýerine laýyk gelýän nyşana yzygiderliligini we RNK şablonyny öz içine alýar. Soňra pegRNK esasy öýjüklere esasy redaktirleme nukleazasy (PE2) bilen bilelikde girizilýär. PE2 Cas9 fermentinden, ters transkriptazadan we esasy redaktirleme adapterinden ybarat bolan birleşme belogydyr (Martín-Alonso we başg., 2021). Öýjük içinde pegRNA we PE2 kompleksleri üýtgetmek isleýän anyk DNK-ny gözleýär. Cas9 fermenti DNK-ny kesýär we ýekeje zynjyrlardan ybarat şablon döredýär (Çoý we beýlekiler, 2022). Ters transkriptaza bu şablony DNK-ny redaktirlemäge taýýarlamak üçin ulanýar. DNK-ny göçürmek bilen birlikde, RNK şablonyny redaktirlemek boýunça görkezmeler hem goşulýar. Ahyrsoňy, täze döredilen DNK zynjyry DNK-daky döwülmäni dikeltmek üçin şablon hökmünde ulanylýar we netijede islenýän üýtgedilen DNK yzygiderligi emele gelýär (Oçoa-Sançez we beýlekiler, 2021). Primer redaktirleme mehanizmleri genlerde giňden ýaýran mutasiýalara getirip biler. Ol nokat mutasiýalaryny, goşulmalary, pozulmalary we hatda gen çalşyrmalaryny nyşana alyp biler (Anzalone we beýlekiler, 2019; Çen we Liu, 2023). Primer redaktirleme öňki genom redaktirleme tehnologiýalaryna garanyňda birnäçe artykmaçlyklary hödürleýär. Bularyň arasynda takyklygyň ýokarlanmagy, nyşanadan daşary täsirleriň azalmagy we DNK-nyň iki zynjyrly döwülmelerine bil baglamazdan DNK-ny redaktirlemek mümkinçiligi bar (Anzalone we beýlekiler, 2020).
CRISPR/Cas9 tehnologiýasy ilki başda bakteriýalary plazmid geçişinden we fag infeksiýasyndan goramak üçin işlenip düzüldi we soňra genom redaktirlemek üçin netijeli RNK esasly DNK nyşana alyş guraly hökmünde gaýtadan ulanyldy (Jiang we Doudna, 2017). Mundan başga-da, CRISPR/Cas9 ulgamynyň degişlilikde bakteriýa we arheal genomlaryň 50% we 87% -inde bardygy habar berildi (Ishino we beýlekiler, 2018). CRISPR/Cas9 in vivo we in vitro režimlerini ulanyp, islendik anomal genetiki yzygiderliligi pozmak, goşmak we düzetmek üçin mümkin guraldyr (Sabit we beýlekiler, 2021). Mundan başga-da, CRISPR/Cas9 gyzyklanma bildirilýän maksatly genler üçin özboluşlylygy sebäpli adaptiw immun ulgamynyň bir bölegi bolup çykdy (Chen we Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 Cas9 we ýeke-täk ýol görkeziji RNK-dan (sgRNA) ybarat. Cas9 köp sanly belok komponentlerinden düzülen endonukleazadyr. Mundan başga-da, Cas9 iki bölekden ybarat bolany üçin özboluşly gurluş we konformasiýa häsiýetlerine eýedir (Pacesa we başg., 2022). REC bölegi üç sebite bölünýär: REC1, REC2 we köpri spirallary (Cromwell we başg., 2018). NUC üç bölekden, ýagny RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH we protospacer goňşy motiw (PAM) özara täsir domeninden ybarat (1-nji surat) (Song we başg., 2016). sgRNA iki bölekden, şol sanda CRISPR RNK-dan (crRNA) we transkodlaýan kiçi RNK-dan (izleýji RNK) ybarat (1-nji surat). sgRNA, effektor toplumy hökmünde hem belli bolan işjeň kompleksi emele getirmek üçin Cas9 belogyny konneksinlere birikdirýär (Richter we başg., 2012). crRNA, maksatly DNK yzygiderliklerini tanamakda möhüm rol oýnaýan 18–20 nukleotid esas jübütidir. Mundan başga-da, crRNA maksatly DNK bilen jübütleşýär we tracrRNA, Cas9 nukleazasynyň maksatly DNK-ny baglanyşdyrmagy üçin skelet hökmünde hereket edýär (Manghwar we başg., 2019). Beýleki tarapdan, PAM yzygiderliginde 3 nukleotid bar, bu bolsa effektor toplumynyň DNK-a baglanmagyny tassyklaýar, kesgitleýär we araçylyk edýär. Cas9 belog toplumynyň RuvC we HNH kiçi birlikleri katalitik işjeňlige eýedir (Richter we başg., 2012; Asmamaw we Zawdie, 2021). Cas9 kiçi birliginiň HNH nukleaza domeni crRNA bilen baglanyşykly DNK zynjyryny bölýär. RuvC nukleaza domeni beýleki DNK zynjyrlaryny bölýär we iki zynjyrly arakesmeleri (DSB) döredýär, şondan soň iki dürli DNK arakesmesini dikeltmek mehanizmi işjeňleşdirilýär (Jiang we Doudna, 2017) (1-nji surat).
Surat 1. CRISPR/Cas9-a umumy syn (A). CRISPR/Cas9 ulgamynyň bölekleri: (i). Cas9 endonukleazasy maksatly DNK yzygiderliligini kesmek üçin jogapkärdir, (ii) crRNA we tra-crRNA himeralarynyň birleşmeginden dörän ýeke-täk ýol görkeziji (sg) RNK. (iki). Cas9 degişli funksiýalary bolan Rec I, Rec II, NUC lobu (HNH we Ruv C kiçi böleklerdir) we PAM özara täsir domeni (C) ýaly birnäçe bölekleri öz içine alýar. CRISPR/Cas9 belok toplumy DNK yzygiderliliklerini goşmaça däl we goşmaça görnüşlere bölýär (D). CRISPR/Cas9 genomy üç tapgyrda redaktirleýär: tanamak, kesmek we abatlamak. Taýýarlanan sg-RNK Cas9-a ýol görkezýär we gerekli yzygiderliligi goşmaça komponent crRNA arkaly tanaýar. Cas9 PAM yzygiderliligini 5′-NGG-3′-da tanaýar we DNK-ny eredip, DNK-RNA gibridini emele getirýär we bölünmegi işjeňleşdirýär. Cas9-yň HNH domeni komplementar zynjyry bölýär, RuvC domeni bolsa komplementar däl zynjyry bölýär. CRISPR/Cas9 dsDNK-ny iki usulda bölüp, ony abatlaýar: gomologik däl uç birleşmesi (NHEJ) we gomologiýa gönükdirilen abatlama (HDR). NHEJ iki zynjyrly DNK-ny daşary ýurtly gomologik DNK ýok wagty fermentatiw proses arkaly abatlaýar, bu bolsa tötänleýin DNK yzygiderliklerini goşup ýa-da aýryp bilýän ýalňyşlyga meýilli mehanizmdir. HDR örän aýratyndyr we gomologik DNK şablonlaryny talap edýär.
CRISPR/Cas9 arkaly amala aşyrylýan abatlaýyş ýollaryna gomologik däl uç birleşme (NHEJ) we gomologiýa gönükdirilen abatlaýyş (HDR) mehanizmleri girýär. NHEJ ýalňyşlyga meýilli ýoldur, sebäbi ol goşulmagy ýa-da pozulmagy öz içine alýar we abatlaýyş mehanizminde hiç hili nusga talap etmeýär. Ol standart beloklary döretmek üçin tötänleýin nukleotidleri ulanýar (Abbasi we beýlekiler, 2021). Bu abatlaýyş ulgamy KU toplumy, özara utgaşdyrylýan belok toplumy 4-nji görnüş (XRCC-4), DNK uç işleme fermenti we belok kinaza DNK-PKcs ýaly dört kompleksden ybarat (Abbasi we beýlekiler, 2021). KU kompleks belogynyň iki kiçi birligi bar, Ku 70 we Ku 80 we NHEJ mehanizminde möhüm rol oýnaýar, sebäbi abatlaýyş mehanizmi iki kiçi birligiň (Ku 70 we Ku 80) nyşana DNK-nyň küt ýa-da diýen ýaly küt uçlaryna baglanmagy bilen başlanýar (Abbasi we başg., 2021), şikeslenme ýerine NHEJ bilen baglanyşykly beýleki faktorlary çekmek üçin skelet bolup hyzmat edýär (Yang we başg., 2020). XRCC-4 we DNK ligazasy degişlilikde 334 we 911 aminokislotadan ybarat we XRCC4-DNK ligazasy IV kompleksi DNK uçlarynyň baglanmagyny höweslendirýär (Chatterjee we başg., 2015). DNK uç işleýiş fermenti, şeýle hem polinukleotid kinaza 3′-fosfat diýlip atlandyrylýar, DNK uç işleýiş fermentidir. Ol DNK-daky 3′P toparyny aýryp we DSB abatlaýyş wagtynda 5′OH toparyny fosforilleşdirip bilýär. Şeýle hem, SSB abatlaýyş ýoluny ulanyp, bir zynjyrly üzülmeleri (SSB) abatlamagy öz içine alýar (Chatterjee we başg., 2015). Protein kinaza DNK-PKcs DNK-a bagly protein kinaza bolup, PIKK-laryň (fosfatidilinozitol 3-kinaza bilen baglanyşykly kinazalar) we ataksiýa telangiektaziýa mutasiýa edilen (ATM) maşgalasynyň katalitik kiçi birliginden, şeýle hem ATM we Rad3 bilen baglanyşykly ATR-lerden ybaratdyr. Zynjyrly üzülmeler (DSB) we bir zynjyrly üzülmeler (Yue we başg., 2020; Peng we başg., 2016).
HDR has takyk we amatly abatlaýyş mehanizmidir, sebäbi maglumat gomologik DNK dupleksiniň bitewi görnüşini ulanyp göçürilýär, emma ol gyz hromatidleriniň bolmagyny talap edýär. Bu süýdemdirijileriň öýjük sikliniň S/G2 fazasynda bolup geçýär. HDR esasan drožži görnüşlerinde bolýar, ýöne NHEJ süýdemdirijilerde örän möhümdir (Burma we beýlekiler, 2006; Abbasi we beýlekiler, 2021). Doly abatlaýyş mehanizmi 1-nji suratda görkezilen.
TNBC genetiki we epigenetiki anomaliýalar sebäpli ýüze çykýandygy sebäpli, CRISPR/Cas9 ulanyp zyýanly genom/epigenomik anomaliýalary düzetmek makul terapewtiki çemeleşme bolup biler (Chen et al., 2019). Mundan başga-da, öýjüklere mahsus transkripsiýa düzgünleşdirişine gatnaşýan käbir transkripsiýa faktorlary rak öýjükleriniň özboluşly aýratynlyklaryny görkezip biler, bu bolsa transkripsiýa düzgünleşdirişiniň rak keselini bejermek üçin ajaýyp çemeleşme bolup biljekdigini görkezýär (Drost et al., 2017). Derman işläp düzmek üçin şişleriň bu molekulýar aýratynlyklaryny, mysal üçin genetiki, epigenetiki we transkripsiýa kemçiliklerini ulanmak kliniki netijeleri gowulandyryp we barlag çykdajylaryny azaldyp biler. CRISPR diňe bir rak dörediji genom nyşanalaryny ýüze çykaryp we kesgitläp bilmeýän, eýsem adam öýjüklerinde onkogenleri redaktirläp, basyp ýatyryp we epigenetiki taýdan üýtgedip bilýän potensial gen redaktirleme guralydyr (1-nji tablisa) (Ahmed et al., 2021). Şiş basyjylary, onkogenleri we derman garşylygyny gözlemek üçin birnäçe CRISPR barlaglary geçirildi. Dürli TNBC onkogenlerini redaktirlemek üçin CRISPR/Cas9-yň ulanylyşy 2-nji suratda görkezilen.
Surat 2. CRISPR/Cas9 ulanyp dürli TNBC onkogenleriniň gen redaktirlemek, netijede şişiň ösüşi we metastazy azalýar. Bu onkogenlere TNBC-niň ýüze çykmagyna we metastazyna gatnaşýan CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 we CXCR7, Crypto1, ROR1 we ST8SIA girýär.
Rak öýjükleriniň göçmegi, inwaziýasy we epitelial-mezenhimal geçiş (EMT) ITGA9 bilen baglanyşyklydyr. Öňki barlaglar ITGA9-yň Notch ýolunda esasy rol oýnaýandygyny we rabdomiosarkoma metastazynda gyzykly rol oýnaýandygyny görkezdi (Molist we başg., 2020). Mundan başga-da, ITGA9-yň döş raky ýaly birnäçe şiş görnüşlerinde hassalaryň prognozy bilen ýakyndan baglanyşyklydygy anyklandy (Wang Z. we başg., 2019). Mundan başga-da, ITGA9-yň bioinformatik seljermesi onuň TNBC-däki ekspresiýasynyň beýleki döş raky görnüşlerine garanyňda ep-esli ýokarydygyny görkezdi. ITGA9 derejesiniň ýokarlanmagy TNBC hassalarynda şiş metastazy we gaýtalanmagy bilen baglanyşyklydyr. ITGA9-yň CRISPR/Cas9 tarapyndan ýok edilmegi rak kök öýjüklerine (CSC) meňzeş häsiýetlere, şiş angiogenezisine, şişiň ösüşine we TNBC-de β-kateniniň dargamagyny höweslendirmek arkaly metastazyň azalmagyna getirdi (Wang Z. we başg., 2019).
Kripto-1 TGF-β maşgalasynyň agzasydyr we irki embriogenez, kök öýjükleriniň saklanmagy we rak metastazy üçin möhümdir (Ishii we başg., 2021). Tdgf-1 diýlip hem atlandyrylýan bu protein, ilkinji zolaklaryň, mezodermanyň we endodermanyň emele gelmeginiň düzgünleşdirilmegine, şeýle hem embriogenez döwründe beden agzalarynyň ösüşinde çep/sag assimetriýasynyň döredilmegine gatnaşýan onkogen GPI-de berkidilen signallaşdyryjy belogdyr (Zhang we başg., 2021b). Mundan başga-da, Kripto-1-iň kök öýjük markeri hökmünde epitelial-mezenhimal geçişe (EMT) gatnaşýandygy görkezildi (Zhang we başg., 2021b). EMT diňe embrional ösüş, fibroz we ýaralaryň sagalmagy ýaly dürli prosesler üçin däl, eýsem rak inwaziýasy we metastaz üçin hem möhümdir. Mundan başga-da, Kripto-1-iň dört Notch reseptory bilen özara täsirleşýändigi we olaryň terjimeden soňky ýetişmegini güýçlendirýändigi görkezildi (Brandstadter we Maillard, 2019). Notch signallaşdyryş ýolunyň adam süýt mäziniň rak öýjükleriniň saklanmagyna gatnaşýandygy mälim. Barlaglar CRISPR/Cas9 arkaly Kripto-1-iň nokaut edilmeginiň rakyň ösüşini we metastazyny basyp ýatyrýandygyny görkezdi. Şonuň üçin Kripto-1 TNBC üçin möhüm terapewtiki nyşana öwrülip biler (Castro we beýlekiler, 2015).
XCL12 belogy we onuň hemokin reseptory CXC (CXCR4 we CXCR7) rak öýjükleriniň köpelmeginde, ösmeginde, göçmeginde we inwaziýasynda dürli rol oýnaýar (Wu we başg., 2015). Bu hemoreseptorlar in vivo we in vitro modellerinde köp sanly signal ýollary arkaly TNBC-niň ösüşi bilen baglanyşyklydyr (Wu we başg., 2015). Mundan başga-da, CXCR4 we CXCR7-niň aktiwleşmegi TNBC-de metastaza has ýokary duýgurlyk we ýaramaz prognoz bilen baglanyşyklydyr (Karn we başg., 2022). Şonuň üçin CXCR4 we CXCR7-niň nokaut edilmegi, şol sanda TNBC-de süýt mäziniň rak keselini bejermek üçin netijeli derman nyşana genlerine öwrülip biler. Ýaň we başg. tarapyndan geçirilen gözleg. Ýaň we başg. (2019) CXCR4 we CXCR7 genlerini bilelikde nokaut etmek üçin CRISPR/Cas9 ulandy we TNBC-niň köpelmeginiň, ösüşiniň, göçmeginiň we inwaziýasynyň ep-esli derejede basylyp saklanýandygyny anyklady (Ýang we başg., 2019).
Süýt mäziniň rak keseliniň dokumalarynda TNBC onkogeni bolan miR-3662-niň derejesiniň ýokarlanandygy syn edildi (Yi we başg., 2022). miR-3662-niň nokaut edilmeginiň süýt mäziniň rak keseliniň ösüşini we metastazyny in vivo we in vitro şertlerinde togtatýandygy görkezildi (Agarwal we Gupta, 2021). HBP-1 Wnt/-katenin signallaşdyrmagynyň güýçli inhibitorydyr we TNBC öýjükleriniň miR-3662 arkaly ösmegine jogapkär bolmagy mümkin. Ýakynda Yi we başg. miR-3662-HBP1 okunyň TNBC öýjüklerinde Wnt/-katenin signallaşdyryş ýoluny düzgünleşdirýändigini anykladylar (Yi we başg., 2022). Şişlere mahsus ekspresiýasy sebäpli miR-3662 TNBC üçin potensial terapewtiki nyşana bolup biler. Şeýlelik bilen, miR-3662-niň CRISPR/Cas9 arkaly nokaut edilmegi TNBC-ni bejermek üçin täze dermanlary işläp düzmek üçin ajaýyp çemeleşme bolup biler.
UBR5 dürli rak kesellerinde şiş döremeginiň, metastazyň we immun jogabynyň esasy düzgünleşdirijisi hökmünde kesgitlenen 300 kDa nukleofosfoproteindir (Şirer we beýlekiler, 2015; Fu we beýlekiler, 2023). UBR5-iň TNBC nusgalarynda ýokary derejede ýokarlanýandygy we ubikwitin ligaza işjeňligi arkaly proliferasiýany höweslendirmek arkaly ERα funksiýasyny höweslendirýändigi habar berildi (Bolt we beýlekiler, 2015). Esasy TNBC nusgalarynyň tutuş ekzom yzygiderligini öwrenmek işleri hem UBR5-iň ekspresiýasynyň ýokarlanandygyny görkezdi, bu bolsa onuň TNBC-niň ösüşinde rol oýnaýandygyny görkezýär. Mundan başga-da, UBR5-iň CRISPR/Cas9 arkaly ýok edilmegi eksperimental syçan modellerinde TNBC metastazynyň we ösüşiniň möhüm derejede basylyp saklanandygyny görkezdi. Mundan başga-da, UBR5-iň ýabany görnüşli syçan modeline goşulmagy onuň doly funksiýasyny dikeltdi, şol bir wagtyň özünde bu täsir işjeň däl mutant ştammlarda syn edilmedi (Liao we beýlekiler, 2017). UBR5-iň ýetmezçiligi, angiogeneziň gowşaklygy sebäpli TNBC-de apoptozyň, nekrozyň we şişiň ösüşiniň basylyp saklanmagynyň artmagy bilen baglanyşyklydyr. UBR5-iň ýitmegi sebäpli, şişiň uzakdaky organlara ýaýramagy azalýar we UBR5, esasan, E-kadherin ekspresiýasyny azaltmak arkaly anormal EMT-ni döredýär (Zhang we Weinberg, 2018). Ýakynda, UBR5-iň E3 ubikwitinasiýa işjeňliginiň ýetmezçiligi sebäpli TNBC-de IFN-γ bilen baglanyşykly PDL1 transkripsiýasynda örän möhüm faktor bolup durýandygy görkezildi. RNK transkriptom analizi UBR5-iň IFN-γ ýoly bilen baglanyşykly genlere ulgamlaýyn täsir edip biljekdigini we protein kinaz RNK-nyň (PKR) we onuň signal öwrüjileriniň we aktiwatorlarynyň aktiwasiýa derejesini ýokarlandyrmak arkaly PDL1 transaktiwasiýasyny höweslendirip biljekdigini görkezdi. transkripsiýa 1 (STAT1) we interferon düzgünleşdiriji faktor 1 (IRF1). Şeýle-de bolsa, UBR5 we PD-L1 ekspresiýasynyň CRISPR/Cas9 arkaly utgaşdyrylan ablýasiýasy, iki blokadanyň ýeke özi bilen deňeşdirilende, sinergetik terapewtiki täsire eýedir we şişiň mikro gurşawyna çuňňur täsir edýär (Wu we beýlekiler, 2022). Şeýlelik bilen, CRISPR/Cas9 UBR5 funksiýasyny basyp ýatyrmak, şeýlelik bilen TNBC metastazyny we şişiň ösüşini basyp ýatyrmak üçin möhüm gural bolup biler.
ROR1 rak we embrional ösüş döwründe ekspressiýa edilýän we onkofetal protein hökmünde kesgitlenen I görnüşli transmembran proteinidir (Nicholas Borcherding, 2014). Dürli adam rak keselleriniň inwaziw häsiýeti ROR1-iň ýokarlanmagy bilen baglanyşyklydyr. ROR1-i nyşana alýan terapewtiki birleşmeleri öz içine alýan in vivo we in vitro barlaglaryndan umyt beriji netijeler alyndy (Chien we başg., 2016). Süýt dokumalarynyň biopsiýalarynda ROR1 mRNK-nyň ýokary derejesi agressiw bazal görnüşli süýt (BL) şişleri we olaryň bedeniň beýleki böleklerine göçmegi bilen hem baglanyşyklydyr. Mundan başga-da, ROR1-iň artykmaç ekspressiýasy TNBC-niň ösüşiniň prognoz alamaty hökmünde kesgitlenildi (Chien we başg., 2016). Şeýle-de bolsa, TNBC-niň ösüşini we metastazyny basyp ýatyrmak üçin CRISPR/Cas9 ulanyp ROR1-i öçürmek netijeli strategiýa bolardy.
Sialilleşdirme prosesi glikokonjugatlara sial turşusynyň goşulmagyny öz içine alýar, ol bolsa sialiltransferazalar (ST) tarapyndan katalizlenýär. ST8SIA1 ST maşgalasyna degişlidir we limfositik leýkemiýa we göni içege raky ýaly dürli keselleriň patogenezinde möhüm rol oýnaýar (Çang we beýlekiler, 2018). RNK yzygiderliliginiň seljermesi ST8SIA1-iň TNBC näsaglarynyň döş dokumalarynda ýokary derejede ekspresiýa edilýändigini we TNBC-niň patogenezine goşant goşup biljek şiş basyjy gen p53-däki mutasiýalar bilen oňyn baglanyşyklydygyny görkezýär (Battula we beýlekiler, 2017). Mundan başga-da, ST8SIA1 TNBC-niň metastazyna we gaýtalanmagyna gatnaşýar, bu bolsa onuň TNBC-niň ýüze çykmagynda we ösmeginde möhüm rol oýnaýandygyny görkezýär. TNBC-niň in vitro modelinde, CRIPSR/Cas9 tarapyndan ST8SIA1-iň nokdaun edilmeginiň ösüşi we metastazy blokirleýändigi görkezildi (Battula we beýlekiler, 2017). Bu, CRISPR/Cas9-yň TNBC-ni bejermekde ST8SIA1 onkogeniniň funksiýasyny basyp ýatyrmak üçin möhüm gural bolup biljekdigini görkezýär.
NAT1 II faza ksenobiotik birleşmeleriniň emele gelmegini katalizleýän metabolik fermentdir we diýen ýaly ähli adam dokumalarynda beýan edilýär. NAT1 aromatik amin substraty bolmadyk ýagdaýynda hem asetil-KoA (asetil-KoA) nyşana almak üçin kofaktor folaty ulanyp biler (Stepp we beýlekiler, 2015; Laurieri we beýlekiler, 2014). Barlaglar NAT1-iň döş rak keseliniň öýjük modellerinde matrisa metalloproteinaza 9 (MMP9) funksiýasyny kadalaşdyrýandygyny we glýukoza açlygy döwründe reaktiv kislorod görnüşlerinden (ROS) goraýandygyny görkezdi (Wang we beýlekiler, 2018). NAT1-iň aýrylmagynyň piruwatdegidrogenaza toplumynyň işini togtatýandygy we mitohondrial disfunksiýa getirýändigi görkezildi (Wang L. we beýlekiler, 2019). Mundan başga-da, dürli beýleki habarlar kiçi molekulalary we siRNA-ny susdurmak arkaly NAT1-iň togtatmagynyň döş rak keseliniň öýjükleriniň inwaziwligini we köpelmegini azaldyp biljekdigini görkezdi (Stepp we beýlekiler, 2018). Ýakynda CRISPR/Cas9 süýt mäziniň rak keseliniň öýjük liniýasyndaky MDA-MB-231-de NAT1-i basyp ýatyrmak üçin ulanyldy we onuň ekspressiýa derejesine baglylykda öýjük metabolizmasyna täsir etdi. Bu gözleg şeýle hem NAT-1-iň TNBC-niň ösmegi we metastazy üçin möhümdigini görkezdi (Carlisle we beýlekiler, 2020).
Onkogenleriň utgaşdyrylan transkripsiýasy super güýçlendirijiler, transkripsiýa faktorlary we kofaktorlar tarapyndan düzgünleşdirilýär (Hnisz we başg., 2015). Mundan başga-da, transkripsiýanyň düzgünleşdirilmegi üçin CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 we CDK13 ýaly sikline garaşly kinazalaryň (CDK) topary zerurdyr. Olaryň arasynda CDK7 RNK polimeraza II-niň fosforlaşmagyna gatnaşýar, bu bolsa TNBC-niň patogenezinde onkogen transkripsiýasynyň başlangyjy we giňelmegi üçin örän möhümdir. Esasy gözlegde, CRISPR/Cas9 tarapyndan CDK7-niň ýok edilmegi TNBC-niň öňüni aldy, bu bolsa TNBC-niň patogeneziniň CDK7-e garaşlydygyny görkezýär (Wang Y. we başg., 2015).
Barlaglar MYC we RBP-däki (RNK baglanyşly belok) mutasiýalaryň apoptoza getirip biljekdigini, MYC ýa-da RBP-däki ýeke gen mutasiýalarynyň bolsa rak öýjükleriniň ösüşine täsir etmeýändigini görkezdi (Einstein we başg., 2021). Adam genomundaky 1000-den gowrak RBP CRISPR/Cas9 esasly kitaphana arkaly barlandy. Olaryň arasynda 57 RBP-niň MYC derejesi ýokary bolan rak öýjükleriniň ösüşi üçin möhümdigi anyklandy (Wheeler we başg., 2020). Mundan başga-da, YTHDF2 TNBC öýjükleriniň ösüşini saklamak üçin möhümdir we MYC ekspresiýasy ýokary bolan rak öýjüklerinde ýokary derejeli transkripsiýa we terjime wagtynda metillenen transkriptleriň mukdaryny azaldýar. Mundan başga-da, YTHDF2 rak öýjükleri üçin möhüm däl, olar TNBC näsaglarynyň ýaşaýşyny uzaltmak üçin MYC derejesiniň ýokarlanmagyna az baglydyr (Einstein we başg., 2021), bu bolsa onuň TNBC-ni ýeňip biljek dermanlar üçin mümkin bolan terapewtiki nyşana bolup biljekdigini görkezýär.
Sink barmak beloklary (ZNF) umumy adam genomunyň takmynan 1% -ni düzýär. Barlaglar ZNF-niň bagyr rakynda, süýt mäziniň rakynda we göni içege rakynda dürli rak kesellerinde öýjükleriň köpelmegini düzgünleşdirip bilýändigini görkezdi (Zhang W. we başg., 2021; Li we başg., 2017). CRISPR nokauty arkaly döredilen kitaphanalar süýt mäziniň rak öýjüklerinde dürli şiş basyjy genlerini (TSG) barlamak üçin ulanyldy (Shalem we başg., 2014). Şondan bäri, CRISPR/Cas9 ZNF319 bilen öçürilen süýt mäziniň rak öýjükleriniň transkriptomik barlagy ZNF319-yň süýt mäziniň rakynyň köpelmegini azaldýan we şonuň üçin dürli mümkin bolan signal mehanizmlerine we beýleki biologik funksiýalara gatnaşýan şiş basyjy gendigini görkezdi (Wang L. we başg., 2022).
Ferroptoz demriň bolmagyna bagly bolan programmalaşdyrylan öýjük ölüminiň bir görnüşidir. Ferroptozyň ösüşine lipid peroksidleriniň bolmagynyň täsir edýändigi mälim. Mundan başga-da, PKCβII-niň irki lipid peroksidleşmesini görkezýändigi we lipid peroksidleşmesiniň ýokarlanmagy ferroptoz bilen baglanyşyklydygy habar berildi. CRISPR/Cas9 arkaly kinaz ingibitorlarynyň kitaphanasyny barlamak, PKCβII-niň MDA-MB-231 öýjüklerinde ferroptoz üçin möhüm bolan lipid peroksidleşme prosesine gatnaşýandygyny görkezdi (Zhang we beýlekiler, 2022). Şonuň üçin, bu CRISPR/Cas9 tarapyndan PKCβII-niň ýok edilmeginiň ferroptoz bilen baglanyşykly keselleri bejermek üçin mümkin bolan şiş basyjy gen nyşany bolup biljekdigini görkezýär (Zhang we beýlekiler, 2022).
Derman garşylygynyň rak keselinden ejir çekýän hassalarda ölümleriň takmynan 90% -ine sebäp bolýandygy çak edilýär we rak keselini bejermekde esasy kynçylyklaryň biridir (Bukowski we beýlekiler, 2020). Netijeler dermanyň çykarylyşy, DNK-nyň dikeldilmegi, apoptoz we dürli öýjük signal ýollary bilen baglanyşykly ýeterlik mukdarda genleriň derman garşylygy bilen baglanyşyklydygyny görkezýär (Haýder we beýlekiler, 2020). Olaryň arasynda birnäçe gen CRISPR/Cas9 gurallary tarapyndan nyşana alyndy we derman garşylygyny azaltmakda we rak garşy bejergileriň netijeliligini ýokarlandyrmakda umytly netijeleri görkezdi (Vaghari-Tabari we beýlekiler, 2022). Mundan başga-da, ýokary öndürijilikli CRISPR/Cas9 gen nokaut barlag kitaphanalary derman garşylygynyň mümkin bolan gen nyşanalarynyň funksiýasyny üýtgetmekde aýyplanýar (Shalem we beýlekiler, 2015). Paklitaksel garşylyk genlerini kesgitlemek üçin, gaýtalanýan TNBC-li näsaglarda derman garşylygy bilen baglanyşykly bolan giston deasetilaza 9 (HDAC9) ýaly sekiz kandidat genini kesgitlemek üçin genom boýunça sgRNA kitaphanasynyň skriningi bilen birleşdirilen RNK yzygiderliligi ulanyldy (B we başg., 2020). Başga bir gözlegde, rak garşy dermanlar bilen bejerilen TNBC näsaglarynyň diri galmagy döwründe diserin/treonin we tirozin protein kinazasynyň (DSTYK) ekspresiýasynyň ýokarlanandygy syn edildi. Mundan başga-da, DSTYK-nyň CRISPR/Cas9 arkaly nokaut edilmegi in vitro derman garşylykly rak öýjükleriniň (SUM102PT öýjükleri we MDA-MB-468 öýjükleri) we in vivo TNBC modelini ep-esli güýçlendirdi (Ogbu we başg., 2021).
TNBC-de MAPK ýolunyň adatdan daşary aktiwleşmesi bolsa-da, MEK-ni maksat edinýän terapiýalaryň kliniki täsiri pes. CRISPR/Cas9 genom kitaphanasynyň barlagy PSMG2-niň (proteom ýygnaýjy şaperon 2) inhibisiýasynyň TNBC BT549 we MB468 öýjüklerini MEK inhibitory AZD6244-e duýgurlaşdyrýandygyny görkezdi. PSMG2-niň CRISPR/Cas9 nokaut edilmegi normal proteasoma funksiýasyny üýtgetdi, bu bolsa PDPK1-iň awtofagiýa arkaly dargamagyna getirdi, şeýlelik bilen AZD6244 (MEK inhibitory) we MG132 (proteasoma inhibitory) tarapyndan induksiýa edilen TNBC syçan modellerinde şiş öýjüklerini has-da gowulandyrdy. Şeýlelik bilen, proteasoma we MAP kinaza (MEK) inhibitory şiş öýjükleriniň köpelmegini azaltmak üçin sinergiki taýdan ulanylyp bilner (Wang X. we beýlekiler, 2022).
CRISPR/Cas9 şeýle hem TNBC garşylygyna getirýän gen funksiýasynyň ýitmegini barlamak üçin ulanyldy (Şu we beýlekiler, 2020). Ge we beýlekiler TNBC-de BET bromdomain ingibitory (BBDI) bolan JQ1 bilen bejerilen rak öýjükleriniň derman garşylygynyň mehanizmini düşündirdiler. CRISPR/Cas9 ulanyp, olar rb1 geniniň ýok edilmeginiň TNBC-niň rak garşy derman JQ1-e garşylykly bolmagyna sebäp bolandygyny anykladylar. Şonuň üçin rb1 funksiýasy TNBC-de JQ1 dermanlaryna jogap bermekde möhümdir. Şeýle hem, olar paklitakseliň CDK4/6 kinaz/mikrotubula ingibitorydygyny we onuň JQ1 ýaly BBDI-ler bilen utgaşdyrylmagynyň dermana garşy TNBC-e umyt beriji terapewtiki jogaplar berip biljekdigini habar berdiler (Ge we beýlekiler, 2020).
Uzyn kodlaşdyrmaýan RNK-nyň (lncRNA) transkripsiýa landşaftynyň TNBC-de neoadjuwant terapiýasyna garşylyk görkezýändigi habar berildi. Bu gözleg bäş dürli MALAT1 lncRNA transkriptleriniň TNBC-de ýokary derejede ekspresirlenýändigini görkezýär. Mundan başga-da, MALAT1-iň CRISPR/Cas9 arkaly delesiýasy TNBC BT-549 öýjükleriniň paklitaksele we doksorubisine duýgurlygyny ýokarlandyrdy, bu bolsa TNBC-de MALAT1 garşylygynyň mümkin bolan rolyny görkezýär (Shaath we beýlekiler, 2021).
BRCA1-däki (BRCA1m) mutasiýalar dürli-dürli we şonuň üçin anyklamak kyn. BRCA1-iň sintetiki öldüriji hyzmatdaşy bolan PARP1-i (poli(ADP-riboza) polimerazany) nyşana almak TNBC dermanynyň himiosensitiwligini ýokarlandyryp biler. CRISPR/Cas9 ulanyp, PARP1-iň delesiýasy doksorubisin, gemsitabin we dosetaksel ýaly rak garşy dermanlaryň mBRCA1 mutant TNBC öýjüklerine duýgurlygyny ýokarlandyrdy, bu bolsa PARP1-iň TNBC-de derman garşylygyna hem gatnaşýandygyny görkezýär (Vaghari-Tabari we beýlekiler, 2022). BRCA1 ýa-da BRCA2 şiş basyjy genlerindäki mutasiýalaryň adamlarda süýt mäziniň rak keseliniň döremeginiň ähtimallygyny ýokarlandyrýandygy mälim. Bu näsaglary bejermek üçin PARP ingibitorlaryny ulanmak gerek. Mundan başga-da, CRISPR/Cas9 ulanyp nukleotid halas ediş faktory DNPH1-i ýok etmegiň zäherli nukleotid 5-gidroksimetildeoksiuridin (hmdU) monofosfaty aýryp biljekdigi, şeýlelik bilen BRCA ýetmezçilikli öýjükleriň PARP ingibitorlaryna duýgurlygyna jogabyny güýçlendirýändigi görkezildi (Fugger). Şeýlelik bilen, CRISPR/Cas9 we PARP1 ingibitorlary TNBC üçin möhüm bejeriş strategiýasyna öwrülip biler.
Penetran glikoprotein (P-gp) geni, adatça, ähli TNBC-leriň takmynan 41% -inde ýokarlanýan köp dermana garşylyk genidir (Sun we beýlekiler, 2020). P-gp sebäpli dermanyň çykarylyşy süýt mäziniň rak keselinde dermana garşylygyň esasy düzgünleşdirijisi hökmünde kesgitlenildi. P-gp ingibitorlary süýt mäziniň rak keselinde rak garşy dermanlara duýgurlygyň ýokarlanandygyny görkezdi (Famta we beýlekiler, 2021). Şeýlelik bilen, CRISPR/Cas9 arkaly P-gp we P-gp ingibitorlarynyň ablýasiýasy ýa-da basylyp ýatyrylmagy TNBC-de dermana garşylygy ýeňip geçmegiň örän möhüm usullary bolup biler.
ATP-baglanyşykly kasset daşaýjy G2 (ABCG2) TNBC-de derman garşylygyny döredýändigi mälim (Palasuberniam we başg., 2015), emma häzirki wagtda CRISPR/Cas9 we ABCG2-niň susdurylmagy bilen şiş basyjy geniniň işjeňsizleşdirilmegi arasyndaky gatnaşyk barada hiç hili maglumat ýok. PTEN ABCG2 aktiwleşdirmesini güýçlendirip biler (Palasuberniam we başg., 2015), (Deepak Singh we başg., 2021). Şonuň üçin, ABCG2-ni aýyrmak üçin CRISP/Ca9 ulanmak we ony ABCG2 ingibitory bilen utgaşdyrmak TNBC-de derman garşylygyny ýeňip geçmek üçin amatly bejergi bolup biler. 2-nji tablisada CRISPR/Cas9-yň ähli garşylyk genlerine gönükdirilendigi aýdylýar.
2-nji tablisa. CRISPR/Cas9 öýjükleri rak garşy dermanlara duýgurlaşdyrmak üçin dürli TNBC garşylyk genlerini nyşana alýar.
CRISPR/Cas9 kitaphanalary rak patogenezi bilen baglanyşykly gen mutasiýalaryny barlamak üçin mümkin gurallardyr (Chan we beýlekiler, 2022). Bu barlamak usuly (a) kitaphana gurmak, (b) lentiwirus transduksiýasy, (c) fenotipik barlamak we (d) nyşana gen analizi ýaly dört ädimden ybarat. TNBC-de MAPK ýolunyň adatdan daşary aktiwleşmesi bolsa-da, PTEN, RB1 we TP53 ýaly şiş basyjy genlerinde mutasiýalary göterýän TNBC näsaglary üçin MEK maksatly terapiýanyň kliniki prognozy örän pesdir.
Mundan başga-da, CRISPR/Cas9 ulanyp gen nokaut barlagy dehidrokatrolyň MDA-MB-231-e täsirini düşünmek üçin Gwatemala gül we ýaprak ekstraktlarynda köp bolan iň güýçli we selektiw molekula bolan dehidrokatroly synagdan geçirdi. Selektiw öýjük sitotoksikliginiň mehanizmleri. TNBC alt görnüşleriniň mezenhim kökleriniň häsiýetnamalary. Bu CRISPR/Cas9 esasynda barlag, 17β-gidroksisteroid dehidrogenaza 11-i kodlaýan geniň HSD17B11-iň MDA-MB-231 öýjüklerinde ýokary derejede ekspresiýa edilýändigini we MDA-MB-231 öýjükleri üçin aýratyn dehidrofalkarinola getirýändigini hem görkezdi (Grant we beýlekiler, 2020). Şeýlelik bilen, bu CRISPR/Cas9 genom barlagynyň mümkin bolan tebigy birleşmeleriň rak garşy häsiýetleriniň esasynda ýatan mehanizmleri kesgitlemekde uly mümkinçilikleriň bardygyny görkezýär.
Mundan başga-da, TNBC-niň rak keseline garşy gowşaklygy onkogen we şiş basyjy ýollaryň arasyndaky baglanyşygy görkezýän bitarap genom boýunça in vivo CRISPR/Cas9 ekrany arkaly öwrenildi. mTOR we Hippo ýollarynyň esasy bölekleriniň TNBC-de şişiň düzgünleşdirilmeginde möhüm rol oýnaýandygy habar berildi. Mundan başga-da, barlaglar mTORC1/2 we YAP onkoproteininiň farmakologiki inhibisiýasynyň in vitro derman-matris sinergiýa modelini we in vivo hassalardan alynýan ksenograftlary ulanyp TNBC-niň patogenligini netijeli basgylaýandygyny görkezdi. Mundan başga-da, Torin-1 arkaly mTORC1/2 inhibisiýasy makropinotsitozy güýçlendirýär, werteporfin bilen döredilen YAP inhibisiýasy bolsa TNBC öýjükleriniň ölümine getirýär. Jemi alnanda, bu netijeler TNBC üçin täze we netijeli bejeriş usullaryny kesgitlemek üçin genom boýunça in vivo CRISPR ekranynyň güýjüni we ygtybarlylygyny görkezýär (Dai we beýlekiler, 2021).
Immun ulgamynyň düzgünleşdirilmezligi şiş döremeginiň möhüm faktorydyr. Rak öýjükleri goranyş mehanizmlerini aýlanyp geçmek, şol sanda şiş mikro gurşawynda immun öýjükleriniň işjeňligine päsgel bermek we immun ulgamyna zyýan ýetirmek arkaly immun arassalaýyşdan gaça durýarlar. Şonuň üçin, immun ulgamyny gowulandyrmak şişlere garşy göreşmegiň esasy usuly bolup biler. CRISPR/Cas9 esasynda gen modifikasiýasyny ulanmak immun disfunksiýasy bilen baglanyşykly birnäçe meseläni dürli nukdaýnazardan çözýär. CRISPR/Cas9 süýt mäziniň rakyna garşy şişe garşy immuniteti aşakdaky ýollar arkaly gowulandyrmak üçin ulanyldy (3-nji surat).
3-nji surat. CRISPR/Cas9 immunoterapiýasy TNBC öýjüklerine gönükdirilendir. CDK5-iň ýitmegi we PDL1 we CD155-iň nokaut edilmegi immun ulgamyny güýçlendirýär. Şeýle hem, A2AR-yň ýitmegi we HER2, musin 1 we TEM8 ýaly TAA-laryň nokaut edilmegi CAR-T öýjükleriniň rak öýjüklerini öldürmekdäki netijeliligini ýokarlandyrdy. CRISPR/Cas9 arkaly geçirilýän T öýjükleriniň barlagy p38 kinazasynyň bozulmagynyň T öýjükleriniň şişe garşy işjeňligini güýçlendirýändigini görkezdi. CRISPR/Cas9 tarapyndan üýtgedilen T öýjükleri TCR-iň (T öýjük reseptorynyň) ekspresiýasyny ýokarlandyrýar, netijede T öýjükleri şişe garşy işjeňlige eýe bolýar.
Immunoterapiýanyň maksady immun ulgamyny rak öýjüklerine hüjüm etmäge höweslendirmekdir. Immun barlag nokady beloklarynyň artykmaç ekspresiýasy adatça awtoimmun reaksiýalaryň öňüni alýar, ýöne rak keseliniň olardan gaça durmagyna kömek edip biler (Topalian we başg., 2015). Bu beloklar immun öýjükleriniň ýüzündäki reseptorlara baglanmak arkaly immun reaksiýalarynyň öňüni alýar. Köp sanly barlag nokady beloklary (CD155 we PD-L1 ýaly) immun öýjüklerindäki PD-1 reseptoryna nyşana alýar we esasanam TNBC süýt mäziniň rak keselinde ekspresiýa edilýär (Li Y.-C. we başg., 2020). CRISPR/Cas9 ulanyp PD-L1 ýa-da onuň reseptorynyň nokaut edilmegi immun ulgamyny TNBC şişlerine hüjüm etmäge höweslendirip biler (Yahata we başg., 2019). Mundan başga-da, CDK5-iň CRISPR/Cas9 arkaly ýok edilmegi arkaly PD-L1 ekspresiýasynyň peseldilmegi in vitro we in vivo şişiň ösüşini togtadýandygy görkezildi (Deng we başg., 2020). Süýt mäziniň rak keseliniň in vitro we in vivo modellerinde ösüşiň basylyp saklanmagy, CD155-iň shRNA arkaly azalmagynyň süýt mäziniň rak keseline bejeriş täsiriniň bolup biljekdigini görkezýär (Gao we beýlekiler, 2018).
CAR T öýjükleri şiş bilen baglanyşykly antigenleri (TAA) tanaýan we işjeňligini ýokarlandyrmak üçin gözegçilik nokady beloklaryny nokdaun edip bilýän CAR-lary ekspresirleýär (Li C. we başg., 2020). Süýt mäziniň rak keselinde CAR T öýjük terapiýasy üçin dürli mümkin bolan nyşanalar bar, şol sanda HER2, mucin1 we TEM8 ýaly birnäçe TAA (Bajgain we başg., 2018). Mezotelini nyşana alýan CAR T öýjükleriniň (TNBC BT-459 öýjüklerinde artykmaç ekspresirlenen) PD-1 CRISPR/Cas9 ulanylyp nokdaun edilende raka garşy has täsirli bolýandygy barada subutnamalar bar (Hu we başg., 2019). Şeýle-de bolsa, T öýjüklerini hassalardan bölüp almak we soňra olary ex vivo redaktirlemek köp zähmet we wagt talap edýän prosesdir. Ählumumy T öýjükleri izolýasiýa talaplaryny azaldyp bilse-de, transplantatyň garşy eýe anomaliýalarynyň öňüni almak üçin adam leýkosit antigeni (HLA) I synpyny we T öýjük reseptoryny (TCR) ekspresirleýän donor T öýjükleri aýrylmalydyr (Ren we başg., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9 ulanyp, HDR bir wagtyň özünde TCR we HLA-ny ýok edip, CAR-y kodlaýan geni ýok edip biler. Barlaglar CRISPR/Cas9-yň TCR lokusyna anti-CD19 CAR-lary girizmek üçin ulanylyp bilinjekdigini we şeýdip T öýjüklerini ýok etmezden CAR-lary netijeli öndürip biljekdigini görkezdi (Dimitri we başg., 2022). Multipleks tehnologiýalary TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), HLA-I kiçi birligini we PD-1 we CTLA-4 ýaly beýleki beloklary bir wagtyň özünde ýok etmek arkaly allogen CAR T öýjüklerini döretmek üçin işlenip düzüldi, bu bolsa TNBC-e garşy has uly rak garşy häsiýetlere eýe bolup biler (Eyquem we başg., 2017; Liu we başg., 2017; Ren we başg., 2017b; Dimitri we başg., 2022).
CRISPR/Cas9 ulanmak CAR-T öýjükleriniň netijeliligini ýokarlandyryp biler. Adenoziniň immunosupressiw häsiýetlere eýedigi we T öýjükleriniň funksiýasyny blokirlemek we adenozin A2A reseptorlaryny (A2AR) işjeňleşdirmek arkaly rak garşy immuniteti peseldip biljekdigi mälim (Vigano we başg., 2019). CRISPR/Cas9 ulanyp A2AR-y öçürmek in vivo CAR-T öýjükleriniň netijeliligini ep-esli ýokarlandyrdy (Giuffrida we başg., 2021). T öýjükleriniň öýjük giňelmegi, tapawutlanmagy, oksidatiw stress we genom stressi ýaly dürli fenotipik häsiýetleri görkezýändigi mälim. CRISPR/Cas9 esasynda T öýjükleriniň barlagy 25 dürli T öýjük reseptor kinazalarynyň bozulmagyny ýüze çykardy. Olaryň arasynda p38 kinazanyň ýok edilmeginiň T öýjükleriniň şiş garşy işjeňligini güýçlendirýändigi görkezildi, bu bolsa p38 kinazanyň CAR-T öýjükleriniň düzgünleşdirilmeginiň esasy düzgünleşdirijisidigini görkezýär (Gurusamy we başg., 2020).
T öýjüklerini CRISPR/Cas9 ulanyp genetiki taýdan üýtgedilip, ýokary derejede ekspresirlenen TCR-leri öndürip bolýar. Genetiki taýdan üýtgedilen T öýjüklerini hassalara geçirmek endogen T öýjüklerine garanyňda has güýçli rak garşy işjeňligi görkezdi. Şonuň üçin endogen TCR-ler hassalarda genetiki taýdan üýtgedilen TCR-ler bilen bäsleşip biler, bu bolsa rak immunoterapiýasynyň mümkinçiligine täsir edip biler. Bu meseläni çözmek üçin, CRISPR/Cas9 ulanyp, alyjy öýjüklerdäki endogen TCR-β-ny aýyrmak we soňra TCR-β T öýjüklerini rak hassalaryna geçirmek endogen TCR jynsy bäsdeşligine mätäçlik bolmazdan has gowy rak garşy immun jogaplaryny görkezip biler (Fan we başg. 2018). Şeýlelik bilen, CRISPR-de üýtgedilen T öýjüklerinden başga, TCR-ler adaty TCR-de geçirilen T öýjüklerine garanyňda şiş antigenlerine müň esse has duýgurdyr. Mundan başga-da, dürli leýkemiýalarda γδ TCR+ CRISPR tarapyndan döredilen üýtgedilen T öýjükleri standart TCR geçişine garanyňda CD4+ we CD8+ T öýjükleriniň has ýokary ekspressiýasyny görkezýär (Legut we başg., 2018). Şeýlelik bilen, CRISPR/Cas9 tarapyndan döredilen modifisirlenen T öýjükleri TNBC-ni ýeňip geçmek üçin netijeli immunoterapiýa usuly bolup biler.
Integrinler öýjük transmembranlarynda bolýan we öýjükleriň öýjük daşyndaky matrisa (EKM) baglanyşyny höweslendirýän öýjük ýapyşma molekulalarydyr (Hamidi we Ivaska, 2018). Integrinleriň düzgünleşdirilmezligi öýjük daşyndaky matrisany üýtgetmek arkaly rak keseliniň ösmegi we göçmegi bilen baglanyşyklydyr we bu bolsa gan aýlanyşynda rak öýjükleriniň ýaşamagyna getirýär (Hamidi we Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9 arkaly integriniň nokaut edilmegi TNBC-de şişiň ösüşini, metastazyny we kolonizasiýasyny haýalladýar. Integrin a5-iň (ITGA5) nokaut edilmeginiň öýken raky ýaly beýleki rak kesellerinde öýjükleriň göçmegini we ösüşini azaldýandygy habar berildi (Ju we beýlekiler, 2017), bu bolsa integrin a5-iň TNBC-niň patogenezinde hem esasy faktor bolup biljekdigini görkezýär.
Adaty embrion kök (ES) öýjük usullaryny ulanyp, nokaut syçanlaryny döretmek köp zähmet talap edýän, wagt talap edýän we netijesiz prosesdir. ES öýjüklerini gomologik rekombinasiýa arkaly nyşana almak, himer syçanlaryny köpeltmek we soňra olary geterozigot syçanlary bilen çakyşdyrmak üçin aýlar we ýyllar gerek bolýar. Köp sanly genetiki mutasiýalary bolan syçanlary döretmek üçin çylşyrymly çakyşdyrmak gerek. Şeýle-de bolsa, CRISPR/Cas9 ulanyp ES öýjükleriniň ablýasiýasy ýa-da CRISPR/Cas9 komponentlerini bir öýjükli döllenen ýumurtgalara mikroinýeksiýa etmek arkaly döredilen syçanlary ulananda köp kynçylyklar ýüze çykdy. Mysal üçin, üýtgeşmeleriň girizilmegi köplenç iki allel lokuslarda bolýar we genlere mahsus däl. Ýakynda CRISPR/Cas9 tehnologiýasyny ulanýan ES öýjükleriniň bir wagtyň özünde 5 gene çenli iki allel mutasiýalary girizip biljekdigi habar berildi (Nishizono we beýlekiler, 2021). Şu maksat bilen, Cas9 mRNK we bäş gene mahsus gRNK bir wagtyň özünde ES öýjüklerine transfeksiýa edildi. Bu, bu proseduranyň geljegini we netijeliligini görkezýär, emma bu mutasiýalar esaslandyryjy liniýalar bäş sany nokaut syçanlaryny öndürmek üçin ösdürilip ýetişdirilende geçen bolmagy mümkin. Bu gözlegde şeýle hem geň galdyryjy açyş habar berilýär: ES öýjükleri genetiki taýdan üýtgedilen syçanlary döretmek üçin indi zerur däl. Munuň ýerine, belli bir gen önümlerini aýyrmak üçin, Cas9 mRNA we gRNA bir öýjükli tapgyrdaky embrionlara girizildi. Netijede, syçanlarda genleriň ýok edilmeginiň netijelerini öwrenmek üçin nazaryýet taýdan ulanylyp bilinjek nokaut esaslandyryjy liniýalar döredildi (Qin we beýlekiler, 2016). Şeýlelik bilen, CRISPR/Cas9 TNBC-ni däp bolan genetiki inženerçilige garanyňda has arzan bahadan bejermek üçin transgen syçanlary döretmäge mümkinçilik berýär. CRISPR/Cas ulgamyny ulanyp, TNBC-de bir ýa-da birnäçe endogen genlerde nokat mutasiýalaryny üstünlikli girizip bilýän täze nokaut syçan modeli işlenip düzüldi. Bu konsepsiýa esaslanyp, TNBC-niň haýwan modelleri hem BRCA1 we p53-iň CRISPR/Cas9 arkaly delesiýasyny ulanyp işlenip düzülip bilner, bu bolsa HR-iň abatlaýyş işiniň ýitmegine, genom durnuksyzlygyna we mutant fenotiplerine getirýär (Annunziato we beýlekiler, 2020).
Häzirki wagtda mammografiýa, magnit-rezonans tomografiýa (MRT) we ultrases ýaly dürli usullar TNBC-ni anyklamak üçin ulanylýar. Şeýle-de bolsa, bu usullaryň käbir çäklendirmeleri bar. Mammografiýa rak öýjükleriniň beýleki organlara göçüp giden metastazlaryny däl-de, ýerli süýt dokumalaryny anyklamak üçin ulanylýar. Ultrasesografiýa TNBC-ni anyklamak üçin ygtybarly usul däl (Chen we Lee-Felker, 2023). MRT ultrases we mammografiýadan has ýokary duýgurlyga eýedir, ýöne onuň anyklaýyş takyklygy çäkli (Sha we Chen, 2022). Dokuma biopsiýasy rak öýjüklerini anyklamagyň inwaziw usulydyr. Şeýle-de bolsa, käbir ýagdaýlarda, iňňe gyzyklanma zolagyndan daşlaşsa, biopsiýa rak dokumasyny sypdyryp biler. Mundan başga-da, ol örän gymmat we hassa üçin trawmatik bolup biler. TNBC dürli görnüşli rakdyr, şonuň üçin biopsiýa rakyň görnüşi barada ýeterlik maglumat bermezligi mümkin. Şonuň üçin TNBC-ni anyklamak üçin täze anyklaýyş taýdan ygtybarly usul gyssagly zerurdyr. CRISPR/Cas9 süýt rakyny anyklamak üçin ýokary duýgur we minimal inwaziw alternatiwa bolup hyzmat edip biler. Şu maksat bilen, TNBC-ni anyklamak üçin PCR usullaryny kämilleşdirmek üçin CRISPR/Cas9 esasly strategiýalar ulanylyp bilner. Ilki bilen, CRISPR ulgamynyň Cas9 we cpf1 beloklary spesifik däl DNK-ny aýyrmak üçin ulanylýar, soňra bu iki belok (Cas9 we cpf1) maksatly DNK-a baglanmazdan öň PAM yzygiderliligini tanap bilýär (Deepak Singh we başg., 2021). Şeýlelik bilen, PCR rak keseliniň ösmegi bilen baglanyşykly mutasiýalary anyklap bilýär. Birnäçe gözlegler dürli rak kesellerinde dürli mutasiýalary anyklamak üçin bu CRISPR esasly strategiýany kabul etdi (Safari we başg., 2019). Şeýlelik bilen, CRISPR esasly PCR usullary TNBC diagnozynyň biopsiýa esasly immunohistokimiýa ýaly inwaziw usullara baglylygyny azaldyp biler.
Gormon reseptorlarynyň düzgünleşdirilişinde genotipik üýtgeşmeler TNBC-de hem görkezildi (Chen we Russo, 2009). Bejergi nokadynda diagnostika üçin mikroçipleri ulanýan CRISPR/Cas9 esasly PCR strategiýalary bu mutasiýalary netijeli gözegçilikde saklap biler (Hajian we başg., 2019). Şeýle hem, saglygy goraýyş işgärlerine TNBC hassalaryndaky anyk mutasiýalar barada degişli maglumatlary berip biler, bu bolsa olaryň bejergisini gowulandyrmaga kömek edip biler. Şeýle-de bolsa, bu utgaşdyrylan usulyň çäklendirmeleri bar. Şonuň üçin, bu CRISPR/Cas-PCR usuly saglygy goraýyşda TNBC diagnozyny goýmak üçin ulanylmazyndan öň giňişleýin ylmy-barlag işleri talap edilýär (Yang we başg., 2019).