Kompýuter tomografiýasy (KT) arkaly anyklanan öýken düwünleriniň differensial diagnozyny goýmak kliniki tejribede kynçylyk bolmagynda galýar. Bu ýerde biz sagdyn gözegçilik toparyny, zyýansyz öýken düwünlerini we I tapgyr öýken adenokarsinomasyny öz içine alýan 480 syworotka nusgasynyň global metabolomyny häsiýetlendirýäris. Adenokarsinomalar özboluşly metabolomiki profilleri görkezýär, zyýansyz düwünler we sagdyn adamlar metabolomiki profillerde ýokary meňzeşlige eýedirler. Açyş toparynda (n = 306) zyýansyz we zyýanly düwünleri tapawutlandyrmak üçin 27 metabolit toplumy anyklandy. Içki tassyklama (n = 104) we daşarky tassyklama (n = 111) toparlarynda diskriminant modeliň AUC degişlilikde 0,915 we 0,945 boldy. Ýol seljermesi zyýansyz düwünler we sagdyn gözegçilik topary bilen deňeşdirilende öýken adenokarsinomasynyň syworotkasynda triptofanyň azalmagy bilen baglanyşykly glikolitik metabolitleriň artandygyny görkezdi we triptofanyň özleşdirilmeginiň öýken rak öýjüklerinde glikolizi höweslendirýändigini görkezdi. Biziň gözlegimiz KT arkaly ýüze çykarylan öýken düwünleriniň töwekgelçiligini bahalandyrmakda syworotka metabolit biomarkerleriniň ähmiýetini görkezýär.
Irki diagnoz rak keselinden ejir çekýänleriň ýaşaýyş derejesini ýokarlandyrmak üçin örän möhümdir. ABŞ-nyň Milli Öýken Rakyny Skrining Synagynyň (NLST) we Ýewropa NELSON barlaglarynyň netijeleri pes dozaly kompýuter tomografiýasy (LDCT) bilen skriningiň ýokary töwekgelçilikli toparlarda öýken rakyndan ölümi ep-esli azaldyp biljekdigini görkezdi1,2,3. Öýken rakyny skrining etmek üçin LDCT giňden ulanylandan bäri, alamatsyz öýken düwünleriniň tötänleýin rentgenografik tapyndylarynyň ýygylygy artmagyny dowam etdirýär4. Öýken düwünleri diametri 3 sm-e çenli fokusly garaňkylyk hökmünde kesgitlenýär5. Biz howply täze döremeleriň ähtimallygyny bahalandyrmakda we LDCT-de tötänleýin ýüze çykarylan köp sanly öýken düwünleri bilen göreşmekde kynçylyklara duçar bolýarys. KT-niň çäklendirmeleri yzygiderli gözegçilik barlaglaryna we ýalňyş oňyn netijelere getirip, gereksiz goşulyşmalara we artykmaç bejergä sebäp bolup biler6. Şonuň üçin öýken rakyny irki tapgyrlarda dogry kesgitlemek we ilkinji anyklamada köp sanly zyýansyz düwünleri tapawutlandyrmak üçin ygtybarly we peýdaly biomarkerleri işläp düzmek zerurlygy bar7.
Gan (syworotka, plazma, periferik gan mononuklear öýjükleri), şol sanda genomika, proteomika ýa-da DNK metilleşmesi8,9,10, öýken rak keseliniň diagnostiki biomarkerleriniň açylmagyna bolan gyzyklanmanyň artmagyna getirdi. Şol bir wagtyň özünde, metabolomika çemeleşmeleri endogen we ekzogen täsirleriň täsiri astyndaky öýjük soňky önümlerini ölçeýär we şonuň üçin keseliň başlangyjyny we netijesini çaklamak üçin ulanylýar. Suwuk hromatografiýa-tandem massa spektrometriýasy (LC-MS) ýokary duýgurlygy we dürli fiziki-himiki häsiýetleri bolan metabolitleri öz içine alyp bilýän uly dinamiki diapazony sebäpli metabolomika barlaglary üçin giňden ulanylýan usuldyr11,12,13. Plazmanyň/syworotkanyň global metabolomiki analizi öýken rak keseliniň diagnozy14,15,16,17 we bejerginiň netijeliligi bilen baglanyşykly biomarkerleri kesgitlemek üçin ulanylsa-da,18 öýken düwünleriniň ýaramaz we zyýanly görnüşlerini tapawutlandyrmak üçin syworotka metabolitleriniň klassifikatorlary henizem köp öwrenilmeli. -köp mukdarda ylmy-barlag işleri.
Adenokarsinoma we ýassyk öýjükli karsinoma kiçi öýjükli däl öýken rakynyň (NSCLC) iki esasy görnüşidir. Dürli KT barlaglary adenokarsinomanyň öýken rakynyň iň köp duş gelýän gistologik görnüşidigini görkezýär1,19,20,21. Bu barlagda biz sagdyn gözegçilik topary, zyýansyz öýken düwünleri we KT arkaly anyklanan ≤3 sm-lik jemi 695 gan syworotkasynyň nusgalarynda metabolomika analizini geçirmek üçin ultra-ýokary netijeli suwuklyk hromatografiýasyny-ýokary çözgütli massa spektrometriýasyny (UPLC-HRMS) ulandyk. I tapgyrdaky öýken adenokarsinomasyny barlag. Biz öýken adenokarsinomasyny zyýansyz düwünlerden we sagdyn gözegçilik toparyndan tapawutlandyrýan gan metabolitleriniň panelini anykladyk. Ýoluň baýlaşdyryş analizi, zyýansyz düwünler we sagdyn gözegçilik topary bilen deňeşdirilende öýken adenokarsinomasynda anomal triptofan we glýukoza metabolizminiň ýygy-ýygydan ýüze çykýan üýtgeşmelerdigini görkezdi. Ahyrsoňy, biz LDCT arkaly anyklanan zyýanly we zyýansyz öýken düwünlerini tapawutlandyrmak üçin ýokary spesifikasiýaly we duýgurly syworotka metabolik klassifikatoryny döretdik we tassykladyk, bu bolsa irki differensial diagnoz we töwekgelçiligiň bahalandyrylmagyna kömek edip biler.
Häzirki gözlegde, jyns we ýaş boýunça deňleşdirilen syworotka nusgalary 174 sagdyn gözegçilik toparyndan, öýken düwünleri bolan 292 näsagdan we I tapgyrdaky öýken adenokarsinomasy bolan 229 näsagdan retrospektiw usulda ýygnaldy. 695 adamyň demografik häsiýetnamalary Goşmaça 1-nji tablisada görkezilen.
1a-njy suratda görkezilişi ýaly, Sun Ýat-sen uniwersitetiniň Rak keseli merkezinde jemi 480 sany syworotka nusgasy, şol sanda 174 sany sagdyn gözegçilik (HC), 170 sany ýaramaz düwün (BN) we 136 sany I tapgyr öýken adenokarsinomasy (LA) nusgalary ýygnaldy. Ultra öndürijilikli suwuk hromatografiýasy-ýokary çözgütli massa spektrometriýasy (UPLC-HRMS) ulanylyp, maksatly däl metabolomik profillemek üçin açyş kohortasy. Goşmaça 1-nji suratda görkezilişi ýaly, klassifikasiýa modelini döretmek we tapawutly ýol analizini has giňişleýin öwrenmek üçin LA we HC, LA we BN arasyndaky tapawutly metabolitler kesgitlenildi. Sun Ýat-sen uniwersitetiniň Rak keseli merkezi tarapyndan ýygnalan 104 nusga we başga iki hassahana tarapyndan ýygnalan 111 nusga degişlilikde içerki we daşarky barlaglara sezewar edildi.
a Açyş kohortasyndaky gözleg populýasiýasy ultra-nätijeli suwuk hromatografiýasy-ýokary çözgütli massa spektrometriýasy (UPLC-HRMS) ulanylyp, global serum metabolomikasy analizinden geçirildi. b Sagdyn gözegçilik toparyny (HC, n = 174), zyýansyz düwünleri (BN, n = 170) we I tapgyr öýken adenokarsinomasyny (Los Anjeles, n = 136) öz içine alýan gözleg kohortasyndan 480 serum nusgasynyň umumy metabolomynyň bölekleýin iň kiçi kwadratlar diskriminant analizi (PLS-DA). +ESI, oňyn elektrospreý ionizasiýa režimi, -ESI, negatiw elektrospreý ionizasiýa režimi. c–e Wulkan grafikasynda görkezilen iki toparda (iki guýrukly Wilcoxon belgili dereje synagy, ýalňyş açylyş tizliginiň düzedilen p gymmaty, FDR <0.05) düýpli tapawutly bolçulykdaky metabolitler gyzyl (gatlama üýtgemesi > 1.2) we gök (gatlama üýtgemesi < 0.83) bilen görkezilýär. ) f LA we BN arasyndaky belliklenen metabolitleriň sanynda möhüm tapawutlary görkezýän ierarhik klasterleşdirme ýylylyk kartasy. Çeşme maglumatlary çeşme maglumat faýllary görnüşinde berilýär.
Açyş toparyndaky 174 HC, 170 BN we 136 LA-nyň umumy syworotka metabolomy UPLC-HRMS analizi arkaly analiz edildi. Ilki bilen biz hil gözegçiligi (QC) nusgalarynyň gözegçilik edilmedik esasy komponent analizi (PCA) modeliniň merkezinde berk toplanýandygyny görkezýäris, bu bolsa häzirki barlagyň işiniň durnuklylygyny tassyklaýar (Goşmaça surat 2).
1b suratda görkezilen bölekleýin iň kiçi kwadratlar diskriminant analizinde (PLS-DA) görkezilişi ýaly, biz pozitiw (+ESI) we negatiw (−ESI) elektropreý ionlaşma režimlerinde LA we BN, LA we HC arasynda aýdyň tapawutlaryň bardygyny anykladyk. Şeýle-de bolsa, +ESI we -ESI şertlerinde BN we HC arasynda düýpli tapawutlar tapylmady.
Biz LA bilen HC-niň arasynda 382 tapawutly aýratynlygy, LA bilen BN-niň arasynda 231 tapawutly aýratynlygy we BN bilen HC-niň arasynda 95 tapawutly aýratynlygy tapdyk (Wilcoxon gol çekilen dereje synagy, FDR <0.05 we köp üýtgeşme >1.2 ýa-da <0.83) (.1c-e surat). . Peakslar maglumat bazasyna (mzCloud/HMDB/Chemspider kitaphanasy) garşy m/z gymmaty, saklanma wagty we parçalanma massa spektr gözlegi (Usullar bölüminde jikme-jik beýan edilen) arkaly has giňişleýin belliklendi (Goşmaça maglumatlar 3). Ahyrsoňy, degişlilikde LA bilen BN (1f surat we Goşmaça 2-nji tablisa) we LA bilen HC (Goşmaça 3-nji surat we Goşmaça 2-nji tablisa) üçin köplüginde düýpli tapawutlary bolan 33 we 38 belliklenen metabolit kesgitlendi. Tersine, BN bilen HC-de köplüginde düýpli tapawutlary bolan diňe 3 metabolit kesgitlendi (Goşmaça 2-nji tablisa), bu bolsa PLS-DA-da BN bilen HC-niň arasyndaky gabat gelme bilen gabat gelýär. Bu tapawutly metabolitler biohimiki maddalaryň giň toplumyny öz içine alýar (Goşmaça surat 4). Jemi alnanda, bu netijeler öýken rakynyň irki tapgyryndaky howply özgerişini görkezýän gan plazmasyndaky metabolomda möhüm üýtgeşmeleri görkezýär, bu bolsa öýken düwünçekleri ýa-da sagdyn adamlar bilen deňeşdirilende öýken rakynyň irki tapgyryndaky howply özgerişini görkezýär. Şol bir wagtyň özünde, BN we HC-niň gan plazmasyndaky metabolomynyň meňzeşligi, öýken düwünçekleriniň sagdyn adamlar bilen köp biologik aýratynlyklary paýlaşyp biljekdigini görkezýär. Epidermal ösüş faktory reseptorynyň (EGFR) gen mutasiýalarynyň öýken adenokarsinomasynyň 23-nji kiçi görnüşinde köp duş gelýändigini göz öňünde tutup, sürüji mutasiýalaryň gan plazmasyndaky metabolomyna täsirini kesgitlemäge synanyşdyk. Soňra öýken adenokarsinomasy toparynda EGFR statusy bolan 72 ýagdaýyň umumy metabolomiki profilini seljerdik. Gyzykly tarapy, PCA analizinde EGFR mutant hassalarynyň (n = 41) we EGFR ýabany görnüşli hassalaryň (n = 31) arasynda deňeşdirip boljak profilleri tapdyk (Goşmaça surat 5a). Şeýle-de bolsa, biz EGFR mutasiýaly näsaglarda ýabany görnüşli EGFR bolan näsaglara garanyňda (t synagy, p < 0,05 we gatlaşyk üýtgemesi > 1,2 ýa-da < 0,83) mukdary düýpli üýtgeýän 7 metabolit anykladyk (Goşmaça surat 5b). Bu metabolitleriň köpüsi (7-den 5-si) ýag kislotasynyň oksidlenme ýollarynda möhüm rol oýnaýan asilkarnitinlerdir.
2a suratda görkezilen iş akymynda görkezilişi ýaly, düwünleri klassifikasiýa etmek üçin biomarkerler iň az absolýut kiçelme operatorlaryny we LA (n = 136) we BN (n = 170)-de anyklanan 33 sany differensial metabolitlere esaslanýan saýlamany ulanyp alyndy. Üýtgeýänleriň iň gowy utgaşmasy (LASSO) – binar logistik regressiýa modeli. Modeliň ygtybarlylygyny barlamak üçin on esse özara barlag ulanyldy. Üýtgeýänleriň saýlamagy we parametrleriň kadalaşdyrylmagy λ24 parametri bilen ähtimallygyň iň ýokary derejä çykarylmagy bilen sazlanýar. Diskriminant modeliň klassifikasiýa işini barlamak üçin global metabolomika seljermesi içki barlag (n = 104) we daşarky barlag (n = 111) toparlarynda garaşsyz ýagdaýda geçirildi. Netijede, açyş toplumyndaky 27 metabolit iň uly ortaça AUC gymmaty bolan iň gowy diskriminant model hökmünde kesgitlenildi (2b surat), olaryň arasynda 9-synyň işjeňligi BN-e garanyňda ýokarlandy we 18-siniň işjeňligi pes boldy (2c surat).
Öýken düwünleriniň klassifikatoryny gurmak üçin iş akymy, şol sanda on esse özara barlag arkaly ikilik logistik regressiýa modelini ulanyp, açylyş toplumyndaky iň gowy syworotka metabolitlerini saýlamak we içki we daşarky barlag toplumlarynda öňünden çaklaýyş işini bahalandyrmak. b Metabolik biomarker saýlamak üçin LASSO regressiýa modeliniň özara barlag statistikasy. Ýokarda berlen sanlar berlen λ-da saýlanan biomarkerleriň ortaça sanyny görkezýär. Gyzyl nokatly çyzyk degişli lambdadaky ortaça AUC gymmatyny görkezýär. Çal ýalňyşlyk çyzyklary minimal we maksimum AUC gymmatlaryny görkezýär. Nokatly çyzyk saýlanan 27 biomarker bilen iň gowy modeli görkezýär. AUC, kabul edijiniň iş häsiýetnamasynyň (ROC) egrisiniň aşagyndaky meýdan. c Açyş toparyndaky BN topary bilen deňeşdirilende LA toparyndaky 27 saýlanan metabolitiň gatlak üýtgeşmeleri. Gyzyl sütun - aktiwleşdirme. Gök sütun pese gaçyşdyr. d–f Açyş, içki we daşarky barlag toplumlaryndaky 27 metabolit kombinasiýasyna esaslanýan diskriminant modeliň güýjüni görkezýän kabul edijiniň iş häsiýetnamasynyň (ROC) egrileri. Çeşme maglumatlary çeşme maglumat faýllary görnüşinde berilýär.
Bu 27 metabolitiň agramly regressiýa koeffisiýentlerine esaslanyp, çaklama modeli döredildi (Goşmaça 3-nji tablisa). Bu 27 metabolit esasynda geçirilen ROC analizi egri astyndaky meýdanyň (AUC) gymmatynyň 0,933, açyş toparynyň duýgurlygy 0,868 we spesifiklik 0,859 bolandygyny görkezdi (2d-nji surat). Şol bir wagtyň özünde, LA we HC arasyndaky 38 belliklenen tapawutly metabolitleriň arasynda 16 metabolitden ybarat toplum LA-ny HC-den tapawutlandyrmakda 0,801 duýgurlygy we 0,856 spesifikligi bilen 0,902 AUC gazandy (Goşmaça 6a-c surat). Dürli metabolitler üçin dürli gatlak üýtgeme bosagalaryna esaslanýan AUC gymmatlyklary hem deňeşdirildi. Klassifikasiýa modeliniň gatlak üýtgeme derejesi 1,2-e garşy 1,5 ýa-da 2,0-e deň bolanda LA we BN (HC) arasyndaky tapawutlandyrmakda iň gowy netije berendigini anykladyk (Goşmaça 7a, b surat). 27 metabolit toparyna esaslanýan klassifikasiýa modeli içerki we daşarky kohortlarda has-da tassyklanyldy. AUC içki barlag üçin 0,915 (duýgurlyk 0,867, spesifiklik 0,811) we daşarky barlag üçin 0,945 (duýgurlyk 0,810, spesifiklik 0,979) boldy (2e, f surat). Laboratoriýaara netijeliligi bahalandyrmak üçin, daşarky kohortdan 40 nusga Usullar bölüminde beýan edilişi ýaly daşarky barlaghanada seljerildi. Klassifikasiýa takyklygy 0,925 AUC-e ýetdi (Goşmaça surat 8). Öýken ýassyk öýjükli karsinomasy (LUSC) öýken adenokarsinomasyndan (LUAD) soň kiçi öýjükli däl öýken rakynyň (NSCLC) ikinji iň köp ýaýran görnüşi bolany üçin, biz metabolik profilleriň tassyklanan potensial peýdasyny hem barladyk. BN we LUSC-nyň 16 ýagdaýy. LUSC bilen BN arasyndaky tapawutlaryň AUC-si 0,776 boldy (Goşmaça surat 9), bu bolsa LUAD bilen BN arasyndaky tapawutlara garanyňda has pes ukyby görkezýär.
Barlaglar KT suratlaryndaky düwünleriň ululygynyň howply täze döreme ähtimallygy bilen oňyn baglanyşyklydygyny we düwün bejergisiniň esasy kesgitleýjisi bolmagynda galýandygyny görkezdi25,26,27. NELSON barlagynyň uly kohortasyndan alnan maglumatlaryň seljermesi düwünleri <5 mm bolan adamlarda howply täze döreme howpunyň hatda düwünleri bolmadyk adamlardaky howply täze döreme howpuna hem meňzeşdigini görkezdi28. Şonuň üçin, KT gözegçiligini talap edýän iň az ululyk Britaniýanyň Torakal Jemgyýeti (BTS) tarapyndan maslahat berlişi ýaly 5 mm we Fleýşner Jemgyýeti tarapyndan maslahat berlişi ýaly 6 mm29. Şeýle-de bolsa, 6 mm-den uly we aýdyň howply alamatlary bolmadyk, kesgitlenmedik öýken düwünleri (IPN) diýlip atlandyrylýan düwünler kliniki tejribede bahalandyrmakda we dolandyrmakda uly kynçylyk bolmagynda galýar30,31. Soňra biz düwünleriň ululygynyň açyş we içki tassyklama kohortalaryndan alnan umumy nusgalary ulanyp, metabolomik gol çekişlere täsir edip-etmeýändigini barladyk. 27 tassyklanan biomarkere ünsi jemläp, ilki bilen HC we BN sub-6 mm metabolomlarynyň PCA profillerini deňeşdirdik. Biz HC we BN üçin maglumat nokatlarynyň köpüsiniň gabat gelýändigini anykladyk, bu bolsa iki toparda hem syworotka metabolitleriniň derejesiniň meňzeşdigini görkezýär (3a-njy surat). Dürli ululyk aralyklaryndaky aýratynlyk kartalary BN we LA-da saklanyp galdy (3b-njy surat, c), şol bir wagtyň özünde 6–20 mm aralygynda howply we howply düwünleriň arasynda tapawut bar (3d-nji surat). Bu kohortanyň AUC-si 0,927, spesifikligi 0,868 we 6-20 mm ölçegli düwünleriň howplylygyny çaklamak üçin duýgurlygy 0,820 boldy (3e-nji surat, f). Netijelerimiz klassifikatoryň düwünleriň ululygyna garamazdan, irki howply özgerişlik sebäpli ýüze çykan metabolik üýtgeşmeleri tutup biljekdigini görkezýär.
ad 27 metabolitden ybarat metabolik klassifikatora esaslanyp, görkezilen toparlaryň arasyndaky PCA profilleriniň deňeşdirilmegi. CC we BN < 6 mm. b BN < 6 mm we BN 6–20 mm. LA 6–20 mm-de LA 20–30 mm-e garşy. g BN 6–20 mm we LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e 6–20 mm düwünler üçin diskriminant modeliň işini görkezýän kabul edijiniň iş häsiýetnamasy (ROC) egrisi. f Ähtimallyk gymmatlyklary 6–20 mm ölçegli düwünler üçin logistik regressiýa modeline esaslanyp hasaplandy. Çal nokatly çyzyk optimal kesiş gymmatyny (0.455) görkezýär. Ýokardaky sanlar Los Anjeles üçin çaklanylýan ýagdaýlaryň göterimini görkezýär. Iki taraply Studentiň t testini ulanyň. PCA, esasy komponentleriň derňewi. Egri astyndaky AUC meýdany. Çeşme maglumatlary çeşme maglumat faýllary görnüşinde berilýär.
Teklip edilýän howply täze döremeleriň çaklama modeliniň işini görkezmek üçin öýken düwünleriniň ölçegleri (7–9 mm) meňzeş bolan dört nusga (44–61 ýaş aralygynda) saýlandy (4a, b surat). Ilkinji barlagda 1-nji ýagdaý howply täze döreme bilen baglanyşykly aýratynlyk bolan kalsifikatsiyaly berk düwün hökmünde görkezildi, 2-nji ýagdaý bolsa açyk howply alamatlary bolmadyk kesgitlenmedik bölekleýin berk düwün hökmünde görkezildi. Üç tapgyr gözegçilik KT skanirlemeleri bu ýagdaýlaryň 4 ýyllyk döwürde durnukly galandygyny we şonuň üçin howply düwünler hasaplanýandygyny görkezdi (4a surat). Seriýaly KT skanirlemeleriniň kliniki bahalandyrmasy bilen deňeşdirilende, häzirki klassifikator modeli bilen bir gezeklik syworotka metabolitleriniň analizi bu howply düwünleri ähtimallyk çäklendirmelerine esaslanyp çalt we dogry kesgitledi (1-nji tablisa). 3-nji ýagdaýdaky 4b suratda plewra yza çekilme alamatlary bolan düwün görkezilýär, bu bolsa köplenç howply täze döreme bilen baglanyşyklydyr32. 4-nji ýagdaý howply sebäbiniň subutnamasy bolmadyk kesgitlenmedik bölekleýin berk düwün hökmünde görkezildi. Bu ýagdaýlaryň hemmesi klassifikator modeline laýyklykda howply diýlip çaklanyldy (1-nji tablisa). Öýken adenokarsinomasynyň bahalandyrylmagy öýken rezeksiýasy operasiýasyndan soň gistopatologik barlag arkaly görkezildi (4b-nji surat). Daşarky barlag toplumy üçin metabolik klassifikator 6 mm-den uly öýken düwünleriniň kesgitlenmedik iki ýagdaýyny takyk çaklady (Goşmaça surat 10).
Iki sany gowy däl düwünleriň öýkenleriniň aksial penjiresiniň KT suratlary. 1-nji ýagdaýda, 4 ýyldan soň KT skanirlemesi sag aşaky bölekde kalsifikatsiya bilen 7 mm ölçegli durnukly berk düwüni görkezdi. 2-nji ýagdaýda, 5 ýyldan soň KT skanirlemesi sag ýokarky bölekde diametri 7 mm bolan durnukly, bölekleýin berk düwüni görkezdi. b Öýken rezeksiýasyndan öň I tapgyr adenokarsinomasynyň iki ýagdaýynyň öýkenleriniň aksial penjire KT suratlary we degişli patologiki barlaglar. 3-nji ýagdaýda plewra yza çekilmesi bilen sag ýokarky bölekde diametri 8 mm bolan düwüni görkezdi. 4-nji ýagdaýda çep ýokarky bölekde 9 mm ölçegli bölekleýin berk aýna düwüni görkezdi. Rezeksiýa edilen öýken dokumasynyň gematoksilin we eozin (H&E) boýagy (ölçeg çyzygy = 50 μm) öýken adenokarsinomasynyň asinar ösüş nusgasyny görkezýär. Oklar KT suratlarynda ýüze çykarylan düwünleri görkezýär. H&E suratlary patologoanatom tarapyndan barlanan köp sanly (>3) mikroskopik meýdanlaryň wekilçilikli suratlarydyr.
Netijelerimiz bilelikde alnanda, öýken düwünleriniň differensial diagnozynda syworotka metabolit biomarkerleriniň mümkin bolan gymmatyny görkezýär, bu bolsa KT barlagyny bahalandyrmakda kynçylyklar döredip biler.
Tassyklanan differensial metabolit paneline esaslanyp, biz esasy metabolik üýtgeşmeleriň biologiki özara baglanyşygyny kesgitlemäge synanyşdyk. MetaboAnalyst tarapyndan geçirilen KEGG ýolunyň baýlaşdyryş seljermesi berlen iki toparyň arasynda 6 sany umumy düýpli üýtgedilen ýoly anyklady (LA garşy HC we LA garşy BN, düzedilen p ≤ 0.001, täsir > 0.01). Bu üýtgeşmeler piruwat metabolizminde, triptofan metabolizminde, niasin we nikotinamid metabolizminde, glikolizde, TCA siklinde we purin metabolizminde bozulmalar bilen häsiýetlendirildi (5a-njy surat). Soňra biz absolýut mukdary kesgitlemek arkaly esasy üýtgeşmeleri barlamak üçin maksatly metabolomika geçirdik. Umumy üýtgedilen ýollardaky umumy metabolitleri hakyky metabolit standartlaryny ulanyp, üçlü kwadrupol massa spektrometriýasy (QQQ) arkaly kesgitlemek. Metabolomika barlagynyň nyşana nusgasynyň demografik häsiýetnamalary Goşmaça 4-nji tablisada görkezilen. Global metabolomika netijelerimize laýyklykda, mukdary seljerme BN we HC bilen deňeşdirilende LA-da gipoksantiniň we ksantiniň, piruwatyň we laktatyň köpelendigini tassyklady (5b-nji surat, c, p <0.05). Şeýle-de bolsa, bu metabolitlerde BN we HC arasynda düýpli tapawutlar tapylmady.
LA toparynda BN we HC toparlary bilen deňeşdirilende düýpli tapawutly metabolitleriň KEGG ýolunyň baýlaşdyrylmagynyň seljermesi. Iki taraply Globaltest ulanyldy we p gymmatlyklary Holm-Bonferroni usuly arkaly sazlandy (düzedilen p ≤ 0.001 we täsir ululygy > 0.01). b–d Skripka grafikleri LC-MS/MS arkaly kesgitlenen (toparda n = 70) serum HC, BN we LA-da gipoksantin, ksantin, laktat, piruwat we triptofan derejelerini görkezýär. Ak we gara nokatly çyzyklar degişlilikde medianany we kwartilini görkezýär. e Skripka grafikasy LUAD-TCGA maglumatlar toplumyndaky adaty öýken dokumasy (n = 59) bilen deňeşdirilende öýken adenokarsinomasynda SLC7A5 we QPRT-niň normallaşdyrylan Log2TPM (millionda transkript) mRNA ekspresiýasyny (n = 513) görkezýär. Ak gutu kwartil aralygyny, merkezdäki gorizontal gara çyzyk medianany, gutudan uzalýan dik gara çyzyk bolsa 95% ynam aralygyny (IA) görkezýär. f TCGA maglumatlar toplumynda öýken adenokarsinomasynda (n = 513) we normal öýken dokumasynda (n = 59) SLC7A5 we GAPDH ekspresiýasynyň Pearson korrelýasiýa grafigi. Çal meýdan 95% IA-ny görkezýär. r, Pearson korrelýasiýa koeffisiýenti. g LC-MS/MS arkaly kesgitlenen spesifik däl shRNA gözegçiligi (NC) we shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bilen transfeksiýa edilen A549 öýjüklerinde normallaşdyrylan öýjük triptofan derejeleri. Her topardaky bäş biologik taýdan garaşsyz nusganyň statistik seljermesi görkezilýär. h A549 öýjüklerinde (NC) we SLC7A5 nokdaun A549 öýjüklerinde (Sh1, Sh2) NADt öýjük derejeleri (umumy NAD, şol sanda NAD+ we NADH). Her topardaky üç biologik taýdan garaşsyz nusganyň statistik seljermesi görkezilýär. i SLC7A5 nokdaunyndan öň we soň A549 öýjükleriniň glikolitik işjeňligi öýjük daşyndaky kislotalaşma tizligi (ECAR) bilen ölçeldi (toparda n = 4 biologik taýdan garaşsyz nusga). 2-DG, 2-deoksi-D-glýukoza. (b–h)-da iki guýrukly Studentiň t synagy ulanyldy. (g–i)-da ýalňyşlyk sütunlary ortaça ± SD-ni görkezýär, her synag üç gezek garaşsyz geçirildi we netijeler meňzeş boldy. Çeşme maglumatlary çeşme maglumat faýllary görnüşinde berilýär.
LA toparynda üýtgeýän triptofan metabolizminiň möhüm täsirini göz öňünde tutup, biz QQQ ulanyp, HC, BN we LA toparlarynda gan serumyndaky triptofan derejesini hem bahaladyk. Biz LA-da gan serumyndaky triptofanyň HC ýa-da BN bilen deňeşdirilende azalandygyny anykladyk (p < 0.001, 5d surat), bu bolsa aýlanýan triptofan derejesiniň öýken rak keselinden ejir çekýän näsaglarda gözegçilik toparyndan sagdyn gözegçilik toparyna garanyňda pesdigi baradaky öňki netijeler bilen gabat gelýär33,34,35. PET/KT yzarlaýjy 11C-metil-L-triptofan ulanylan başga bir gözlegde öýken raky dokumasynda triptofan signalynyň saklanma wagtynyň ýaramaz zeperlenmelere ýa-da kadaly dokumalara garanyňda ep-esli artandygy anyklandy36. Biz LA gan serumyndaky triptofanyň azalmagynyň öýken raky öýjükleri tarapyndan işjeň triptofanyň özleşdirilmegini görkezip biljekdigini çaklaýarys.
Triptofan katabolizminiň kinurenin ýolunyň ahyrky önüminiň glikolizde gliseraldegid-3-fosfatyň 1,3-bisfosfogliserat bilen reaksiýasy üçin möhüm substrat bolan NAD+37,38 bolandygy hem mälimdir39. Öňki barlaglar triptofan katabolizminiň immun düzgünleşdirişdäki roluna gönükdirilen bolsa-da, biz häzirki barlagda triptofan düzgünleşdiriş bozulmasy bilen glikolitik ýollaryň arasyndaky özara baglanyşygy düşündirmäge synanyşdyk. Eriýän maddalary daşaýjy maşgalasynyň 7-nji agzasy 5 (SLC7A5) triptofan daşaýjysy hökmünde tanalýar43,44,45. Hinolin turşusy fosforiboziltransferaza (QPRT) kinolin turşusyny NAMN46-a öwürýän kinurenin ýolunyň aşagynda ýerleşýän fermentdir. LUAD TCGA maglumat toplumynyň barlagy SLC7A5 we QPRT-niň hem şiş dokumalarynda kadaly dokumalara garanyňda ep-esli ýokarlanandygyny görkezdi (5e-nji surat). Bu artyş öýken adenokarsinomasynyň I we II tapgyrlarynda, şeýle hem III we IV tapgyrlarynda syn edildi (Goşmaça surat 11), bu bolsa şiş döremegi bilen baglanyşykly triptofan metabolizminiň irki bozulmalaryny görkezýär.
Mundan başga-da, LUAD-TCGA maglumatlar toplumy rak keselinden ejir çekýän näsaglaryň nusgalarynda SLC7A5 we GAPDH mRNA ekspresiýasynyň arasynda oňyn korrelýasiýany görkezdi (r = 0.45, p = 1.55E-26, 5f-nji surat). Tersine, adaty öýken dokumalarynda şeýle gen imzalarynyň arasynda möhüm korrelýasiýa tapylmady (r = 0.25, p = 0.06, 5f-nji surat). A549 öýjüklerinde SLC7A5-iň (Goşmaça 12-nji surat) nokautasiýasy öýjük triptofanynyň we NAD(H) derejesini ep-esli peseltdi (5g,h-nji surat), bu bolsa öýjük daşyndaky kislotalaşma tizligi (ECAR) bilen ölçelýän glikolitik işjeňligiň peselmegine getirdi (1-nji surat). Şeýlelik bilen, syworotkadaky we in vitro anyklaýyşdaky metabolik üýtgeşmelere esaslanyp, triptofan metabolizminiň kinurenin ýoly arkaly NAD+ öndürip biljekdigini we öýken rakynda glikoliziň ösmeginde möhüm rol oýnap biljekdigini çaklaýarys.
Barlaglar, LDCT arkaly anyklanan köp sanly näbelli öýken düwünleriniň, PET-KT, öýken biopsiýasy we howply täze döremeleriň ýalňyş oňyn diagnozy sebäpli artykmaç bejergi ýaly goşmaça barlaglaryň zerurlygyna getirip biljekdigini görkezdi.31 6-njy suratda görkezilişi ýaly, biziň barlagymyz KT arkaly anyklanan öýken düwünleriniň töwekgelçilik gatlaklaryny we soňraky bejergisini gowulandyryp biljek potensial diagnostika gymmatyna eýe bolan syworotka metabolitleriniň panelini anyklady.
Öýken düwünleri pes dozaly kompýuter tomografiýasy (LDCT) arkaly bahalandyrylýar, bu bolsa zyýanly ýa-da zyýanly sebäpleri görkezýär. Düwünleriň netijesiniň näbelli bolmagy ýygy-ýygydan gözegçilik barlaglaryna, gereksiz çärelere we artykmaç bejergä sebäp bolup biler. Diagnostik ähmiýeti bolan syworotka metabolik klassifikatorlarynyň goşulmagy töwekgelçiligiň bahalandyrylmagyny we öýken düwünleriniň soňraky bejergisini gowulandyryp biler. PET pozitron emissiýa tomografiýasy.
ABŞ-nyň NLST we Ýewropa NELSON barlaglaryndan alnan maglumatlar ýokary töwekgelçilikli toparlary pes dozaly kompýuter tomografiýasy (LDCT) bilen barlamagyň öýken rak keselinden ölüm derejesini azaltmagynyň mümkindigini görkezýär1,3. Şeýle-de bolsa, LDCT arkaly ýüze çykarylan köp sanly tötänleýin öýken düwünleriniň töwekgelçiligini bahalandyrmak we soňraky kliniki dolandyrmagy iň kyn mesele bolmagynda galýar. Esasy maksat ygtybarly biomarkerleri goşmak arkaly bar bolan LDCT esasyndaky protokollaryň dogry klassifikasiýasyny optimizirlemekdir.
Gan metabolitleri ýaly käbir molekulýar biomarkerler öýken rakyny sagdyn gözegçilik topary bilen deňeşdirmek arkaly anyklandy15,17. Häzirki gözlegde biz LDCT arkaly tötänleýin ýüze çykarylan zyýanly we zyýanly öýken düwünlerini tapawutlandyrmak üçin syworotka metabolomikasy analiziniň ulanylmagyna üns berdik. UPLC-HRMS analizini ulanyp, sagdyn gözegçilik (HC), zyýanly öýken düwünleriniň (BN) we I tapgyr öýken adenokarsinomasynyň (LA) nusgalarynyň global syworotka metabolomyny deňeşdirdik. HC we BN-niň meňzeş metabolik profilleriniň bardygyny, LA-nyň bolsa HC we BN bilen deňeşdirilende düýpli üýtgeşmeleriň bardygyny anykladyk. LA-ny HC we BN-den tapawutlandyrýan iki sany syworotka metabolitlerini anykladyk.
Häzirki wagtda LDCT esasyndaky howply we howply düwünleri anyklamak shemasy, esasan, düwünleriň wagtyň geçmegi bilen ölçegine, dykyzlygyna, morfologiýasyna we ösüş tizligine esaslanýar30. Öňki barlaglar düwünleriň ölçeginiň öýken rakynyň ähtimallygy bilen ýakyndan baglanyşyklydygyny görkezdi. Hatda ýokary töwekgelçilikli näsaglarda hem düwünlerde howply täze döreme howpy <1% -e deňdir. 6-dan 20 mm-e çenli düwünler üçin howply täze döreme howpy 8% -den 64% -e çenli üýtgeýär30. Şonuň üçin Fleischner jemgyýeti KT gözegçilik üçin kesiş diametrini 6 mm bolmagy maslahat berýär.29 Şeýle-de bolsa, 6 mm-den uly näbelli öýken düwünleriniň (IPN) töwekgelçilik bahalandyrmasy we bejergisi ýeterlik derejede ýerine ýetirilmedi31. Dogabitdi ýürek keseliniň häzirki bejergisi, adatça, ýygy-ýygydan KT gözegçilik bilen seresaply garaşmaga esaslanýar.
Tassyklanan metabolom esasynda, biz ilkinji gezek sagdyn adamlar bilen <6 mm bolan gowy däl düwünleriň arasyndaky metabolomiki alamatlaryň gabat gelýändigini görkezdik. Biologiki meňzeşlik, <6 mm bolan düwünler üçin howply täze döreme howpunyň düwünleri bolmadyk adamlardaky ýaly pesdigini görkezýän öňki KT netijeleri bilen gabat gelýär.30 Biziň netijelerimiziň hem <6 mm we ≥6 mm bolan gowy däl düwünleriň metabolomiki profillerinde ýokary meňzeşlige eýedigini görkezýändigini bellemelidiris, bu bolsa howply däl etiologiýanyň funksional kesgitlemesiniň düwünleriň ululygyna garamazdan yzygiderlidigini görkezýär. Şeýlelik bilen, häzirki zaman diagnostik serum metabolit panelleri düwünler KT-da ilkinji gezek anyklananda bir gezeklik synag hökmünde ýeke-täk synagy hödürläp biler we seriýaly gözegçiligi peseldip biler. Şol bir wagtyň özünde, metabolik biomarkerleriň şol bir paneli ≥6 mm bolan howply düwünleri gowy däl düwünlerden tapawutlandyrdy we meňzeş ululykdaky IPN-ler we KT suratlarynda düşnüksiz morfologiki alamatlar üçin takyk çaklamalar berdi. Bu serum metabolizm klassifikatory ≥6 mm bolan düwünleriň howply täze döremesini 0,927 AUC bilen öňünden aýtmakda gowy netije görkezdi. Netijelerimiz bilelikde alnanda, özboluşly syworotka metabolomiki alamatlarynyň irki şiş sebäpli metabolik üýtgeşmeleri aýratyn görkezip biljekdigini we düwünleriň ululygyndan garaşsyz töwekgelçilik çaklaýjylary hökmünde potensial gymmatlyga eýe bolup biljekdigini görkezýär.
Aýratyn hem, öýken adenokarsinomasy (LUAD) we ýassyk öýjükli karsinoma (LUSC) kiçi öýjükli däl öýken rakynyň (NSCLC) esasy görnüşleridir. LUSC-nyň temmäki ulanmak bilen berk baglanyşyklydygyny47 we LUAD-yň KT barlagynda ýüze çykarylan tötänleýin öýken düwünleriniň iň köp duş gelýän gistologiýasydygyny48 göz öňünde tutup, biziň klassifikator modelimiz I tapgyr adenokarsinoma nusgalary üçin ýörite döredildi. Wang we kärdeşleri şeýle hem LUAD-a ünsi jemläp, irki tapgyrdaky öýken rakyny sagdyn adamlardan tapawutlandyrmak üçin lipidomikleri ulanyp dokuz lipid alamatyny anykladylar17. Häzirki klassifikator modelini I tapgyrdaky LUSC-nyň 16 ýagdaýynda we 74 sany ýaramaz düwünlerde synagdan geçirdik we LUSC-nyň pes çaklama takyklygyny (AUC 0.776) synladyk, bu bolsa LUAD-yň we LUSC-nyň öz metabolomiki alamatlarynyň bolup biljekdigini görkezýär. Hakykatdan-da, LUAD we LUSC-nyň etiologiýasy, biologik gelip çykyşy we genetiki aberrasiýalary boýunça tapawutlanýandygy görkezildi49. Şonuň üçin, skrining maksatnamalarynda öýken rak keselini ilata esaslanýan anyklamak üçin okuw modellerine gistologiýanyň beýleki görnüşleri hem goşulmalydyr.
Bu ýerde biz sagdyn gözegçilik topary we gowy däl düwünler bilen deňeşdirilende öýken adenokarsinomasynda iň köp üýtgeýän alty ýoly anykladyk. Ksantin we gipoksantin purin metabolik ýolunyň umumy metabolitleridir. Netijelerimize laýyklykda, purin metabolizmi bilen baglanyşykly aralyk önümler öýken adenokarsinomasy bolan näsaglaryň ganynda ýa-da dokumalarynda sagdyn gözegçilik topary ýa-da inwaziw tapgyrdaky näsaglar bilen deňeşdirilende ep-esli ýokarlandy15,50. Ganynda ksantin we gipoksantin derejesiniň ýokarlanmagy çalt köpelýän rak öýjükleri tarapyndan zerur bolan anabolizmi görkezip biler. Glýukoza metabolizminiň bozulmagy rak metabolizminiň belli alamatydyr51. Bu ýerde biz HC we BN topary bilen deňeşdirilende LA toparynda piruwatyň we laktatyň ep-esli ýokarlanandygyny synladyk, bu bolsa kiçi öýjükli däl öýken raky (NSCLC) näsaglarynyň we sagdyn gözegçilik toparynyň ganynda metabolom profillerinde glikolitik ýol anomaliýalary baradaky öňki habarlara laýyk gelýär. netijeler ep-esli52,53.
Iň esasysy, öýken adenokarsinomalarynyň ganynda piruwat we triptofan metabolizminiň arasynda ters korrelasiýany synladyk. LA toparynda gandaky triptofan derejesi HC ýa-da BN topary bilen deňeşdirilende peseldi. Gyzykly tarapy, prospektiw kohorta ulanylan öňki uly möçberli gözlegde aýlanýan triptofanyň pes derejesiniň öýken rak keseliniň töwekgelçiliginiň ýokarlanmagy bilen baglanyşyklydygy anyklandy 54. Triptofan, biz doly iýmitden alýan möhüm aminokislotadyr. Öýken adenokarsinomasynda gandaky triptofanyň azalmagynyň bu metabolitiň çalt azalmagyny görkezip biljekdigi barada netije çykardyk. Kinurenin ýoly arkaly triptofan katabolizminiň soňky önüminiň de novo NAD+ sinteziniň çeşmesi bolup durýandygy mälim. NAD+ esasan halas ediş ýoly arkaly öndürilýändigi üçin, saglykda we keselde triptofan metabolizminde NAD+-yň ähmiýeti kesgitlenmeli46. TCGA maglumat bazasyna geçiren seljermemiz, triptofan daşaýjy ergin daşaýjy 7A5-iň (SLC7A5) ekspresiýasynyň öýken adenokarsinomasynda kadaly gözegçilik toparyna garanyňda ep-esli ýokarlanandygyny we glikolitik ferment GAPDH-nyň ekspresiýasy bilen oňyn baglanyşyklydygyny görkezdi. Öňki barlaglar, esasan, triptofan katabolizminiň şişe garşy immun jogabyny basyp ýatyrmakdaky roluna gönükdirildi40,41,42. Bu ýerde biz öýken rak öýjüklerinde SLC7A5-i nokdaun etmek arkaly triptofanyň özleşdirilmeginiň basylyp ýatyrylmagynyň öýjük NAD derejesiniň soňraky peselmegine we glikolitik işjeňligiň bir wagtyň özünde pese gaçmagyna getirýändigini görkezýäris. Gysgaça aýdylanda, biziň barlagymyz öýken adenokarsinomasynyň howply transformasiýasyna bagly bolan gan serumyndaky metabolizmiň üýtgemegi üçin biologik esas döredýär.
EGFR mutasiýalary NSCLC-li näsaglarda iň köp duş gelýän hereketlendiriji mutasiýalardyr. Biziň gözlegimizde, EGFR mutasiýaly näsaglaryň (n = 41) umumy metabolomik profilleriniň ýabany görnüşli EGFR (n = 31) näsaglaryna meňzeşdigini anykladyk, emma asilkarnitin näsaglarynda käbir EGFR mutant näsaglarynyň serum derejesiniň peselendigini anykladyk. Asilkarnitinleriň kesgitlenen funksiýasy asil toparlaryny sitoplazmadan mitohondrial matrisa daşamakdyr, bu bolsa ýag kislotalarynyň oksidlenmegine we energiýa öndürmäge getirýär 55. Biziň gözleglerimize laýyklykda, ýakynda geçirilen gözlegde EGFR mutant bilen EGFR ýabany görnüşli şişleriň arasyndaky meňzeş metabolom profilleri 102 öýken adenokarsinoma dokumasynyň nusgalarynyň global metabolomyny seljermek arkaly anyklandy50. Gyzykly tarapy, asilkarnitin mukdary EGFR mutant toparynda hem tapyldy. Şonuň üçin, asilkarnitin derejesindäki üýtgeşmeleriň EGFR tarapyndan döredilen metabolik üýtgeşmeleri we esasy molekulýar ýollary görkezýändigi has giňişleýin öwrenmäge mynasyp bolup biler.
Netijede, biziň gözlegimiz öýken düwünleriniň differensial diagnozyny goýmak üçin syworotka metabolik klassifikatoryny döredýär we KT skanirlemesine esaslanyp, töwekgelçiligiň bahalandyrylmagyny optimizirläp we kliniki dolandyryşy ýeňilleşdirip bilýän iş akymyny teklip edýär.
Bu barlag Sun Ýat-sen Uniwersitetiniň Rak Keselleri Hassahanasynyň Etika Komiteti, Sun Ýat-sen Uniwersitetiniň Birinji Baglanyşykly Hassahanasy we Çžençžou Uniwersitetiniň Rak Keselleri Hassahanasynyň Etika Komiteti tarapyndan tassyklanyldy. Açyş we içki tassyklama toparlarynda, Sun Ýat-sen Uniwersitetiniň Rak Keselleri Merkeziniň Rak Keselleriniň Gözegçiligi we Öňüni Alyş Bölüminde ýyllyk lukmançylyk barlaglaryndan geçýän adamlardan sagdyn adamlardan 174 sany we zyýansyz düwünlerden 244 sany we zyýansyz düwünlerden 166 sany syworotka ýygnaldy. I tapgyr öýken adenokarsinomalary Sun Ýat-sen Uniwersitetiniň Rak Keselleri Merkezinden ýygnaldy. Daşarky tassyklama kohortasynda zyýansyz düwünleriň 48 ýagdaýy, Sun Ýat-sen Uniwersitetiniň Birinji Baglanyşykly Hassahanasyndan I tapgyr öýken adenokarsinomasynyň 39 ýagdaýy we Çžençžou Rak Keselleri Hassahanasyndan I tapgyr öýken adenokarsinomasynyň 24 ýagdaýy bardy. Sun Ýat-sen uniwersitetiniň rak merkezi, bellenen metabolik klassifikatoryň diagnostika ukybyny barlamak üçin I tapgyrdaky ýassyk öýjükli öýken rakynyň 16 ýagdaýyny hem ýygnady (hassalaryň häsiýetnamalary 5-nji goşmaça tablisada görkezilen). Açyş kohortasyndan we içki tassyklama kohortasyndan nusgalar 2018-nji ýylyň ýanwaryndan 2020-nji ýylyň maýyna çenli ýygnaldy. Daşarky tassyklama kohortasy üçin nusgalar 2021-nji ýylyň awgustyndan 2022-nji ýylyň oktýabryna çenli ýygnaldy. Jyns taýdan kemsitmegi azaltmak üçin her kohorta takmynan deň sanda erkek we aýal ýagdaýlary berildi. Açyş topary we Içerki gözden geçiriş topary. Gatnaşyjynyň jynsy öz-özüniň hasabatyna esaslanyp kesgitlenildi. Ähli gatnaşyjylardan habarly razylyk alyndy we hiç hili kompensasiýa berilmedi. Howpsuz düwünleri bolan subýektler, derňew wagtynda 2 ýyldan 5 ýyla çenli durnukly KT skanirleme balyna eýe bolanlardy, daşarky tassyklama nusgasyndan 1 ýagdaýdan başga, ol operasiýadan öň ýygnaldy we gistopatologiýa arkaly anyklandy. Hroniki bronhitden başga. Öýken adenokarsinomasy ýagdaýlary öýken rezeksiýasyndan öň ýygnaldy we patologiki diagnoz bilen tassyklanyldy. Açyk gan nusgalary antikoagulyantlarsyz syworotka bölüji turbalarda ýygnaldy. Gan nusgalary otag temperaturasynda 1 sagatlap laxtalandy we soňra syworotkanyň üstki bölegini ýygnamak üçin 4°C-da 10 minutlap 2851 × g-da sentrifuga edildi. Syworotkanyň alikvotalary metabolit ekstraksiýa edilýänçä -80°C-da doňduryldy. Sun Ýat-sen uniwersitetiniň Rak keselleri merkeziniň Rak keseliniň öňüni almak we lukmançylyk barlaglary bölümi 40 ýaşdan 55 ýaşa çenli deň sanda erkekler we aýallar bilen birlikde 100 sagdyn donordan syworotkanyň bir bölegini ýygnady. Her bir donor nusgasynyň deň möçberleri garyşdyryldy, emele gelen topar alikvotalaşdyryldy we -80°C-da saklandy. Syworotka garyndysy hil gözegçiligi we maglumatlary standartlaşdyrmak üçin salgylanma materialy hökmünde ulanyldy.
Salgylanma syworotkasy we synag nusgalary eredildi we metabolitler birleşdirilen ekstraksiýa usuly (MTBE/metanol/suw) arkaly ekstraksiýa edildi 56. Gysgaça aýdylanda, 50 μl syworotka 225 μl buz ýaly sowuk metanol we 750 μl buz ýaly sowuk metil tert-butil efiri (MTBE) bilen garyşdyryldy. Garyndyny garyşdyryň we buzda 1 sagatlap inkubasiýa ediň. Soňra nusgalar garyşdyryldy we içki standartlary (13C-laktat, 13C3-piruwat, 13C-metionin we 13C6-izoleýsin, Kembrij izotop laboratoriýalaryndan satyn alnan) öz içine alýan 188 μl MS derejeli suw bilen garyşdyryldy. Soňra garyndy 4 °C-da 10 minutlap 15,000 × g-da santrifuga edildi we aşaky faza oňyn we negatiw režimlerde LC-MS analizi üçin iki turba (her biri 125 μL) geçirildi. Ahyrsoňy, nusga ýokary tizlikli wakuum konsentratorynda gurak bolýança buglandyryldy.
Guradylan metabolitler 120 μl 80% asetonitrilde gaýtadan dikeldildi, 5 minutlap wotekslendi we 4°C-de 10 minutlap 15,000 × g tizlikde santrifuga edildi. Supernatantlar metabolomika barlaglary üçin mikrogoşmalary bolan sary aýna flakonlara geçirildi. Ultra öndürijilikli suwuk hromatografiýa-ýokary çözgütli massa spektrometriýasy (UPLC-HRMS) platformasynda maksatsyz metabolomika seljermesi. Metabolitler Dionex Ultimate 3000 UPLC ulgamy we ACQUITY BEH Amid sütüni (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) ulanylyp bölündi. Pozitiw ion režiminde hereketli fazalar 95% (A) we 50% asetonitril (B) bolup, her biri 10 mmol/L ammonium asetat we 0.1% formik kislota saklady. Negatiw režimde, A we B hereketli fazalary degişlilikde 95% we 50% asetonitril saklaýardy, iki fazada hem 10 mmol/L ammonium asetat bardy, pH = 9. Gradient programmasy aşakdaky ýalydy: 0–0.5 min, 2% B; 0.5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16.1 min, 98–2% B; 16.1–20 min, 2% B. Awtonusmuna alyjyda sütun 40°C-de, nusga bolsa 10°C-de saklandy. Akym tizligi 0.3 ml/min, inýeksiýanyň möçberi 3 μl boldy. Elektrospreý ionizasiýa (ESI) çeşmesi bolan Q-Exactive Orbitrap massa spektrometri (Thermo Fisher Scientific) doly skanirleme režiminde işledi we uly möçberde maglumat ýygnamak üçin ddMS2 gözegçilik režimi bilen birleşdirildi. MS parametrleri aşakdaky ýaly sazlandy: püskürme naprýaženiýesi +3.8 kV/- 3.2 kV, kapillýar temperatura 320°C, gorag gazy 40 arb, kömekçi gaz 10 arb, zond gyzdyryjysynyň temperaturasy 350°C, skanirleme diapazony 70–1050 m/s, çözgüt 70 000. Maglumatlar Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) ulanyp alyndy.
Maglumatlaryň hilini bahalandyrmak üçin, her nusgadan 10 μL üstki gatlagyň alikwotasyny aýyrmak arkaly umumy hil gözegçiligi (QC) nusgalary döredildi. UPLC-MS ulgamynyň durnuklylygyny bahalandyrmak üçin analitiki yzygiderliligiň başynda alty hil gözegçiligi nusgasy inýeksiýasy seljerildi. Soňra hil gözegçiligi nusgalary tapgyra döwürleýin girizilýär. Bu gözlegde syworotka nusgalarynyň 11 tapgyrynyň hemmesi LC-MS arkaly seljerildi. Ekstraksiya prosesini gözegçilikde saklamak we tapgyrdan tapgyra täsirleri sazlamak üçin 100 sagdyn donordan alnan syworotka howuz garyndysynyň alikwotalary degişli tapgyrlarda salgylanma materialy hökmünde ulanyldy. Sun Ýat-sen uniwersitetiniň Metabolomika merkezinde açylyş kohortasynyň, içki tassyklama kohortasynyň we daşarky tassyklama kohortasynyň maksatly däl metabolomika seljermesi geçirildi. Guangdong Tehnologiýa uniwersitetiniň seljerme we synag merkeziniň daşarky laboratoriýasy klassifikator modeliniň işini barlamak üçin daşarky kohortadan 40 nusgany hem seljerdi.
Ekstraksiyadan we gaýtadan döredilenden soň, syworotka metabolitleriniň absolýut mukdary köp reaksiýa gözegçilik (MRM) režiminde elektrospreý ionlaşdyrma (ESI) çeşmesi bilen ultra ýokary öndürijilikli suwuk hromatografiýa-tandem massa spektrometriýasy (Agilent 6495 üçlü kwadrupol) arkaly ölçeldi. Metabolitleri bölmek üçin ACQUITY BEH Amid sütüni (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) ulanyldy. Hereketli faza 10 mmol/L ammonium asetat we 0.1% ammonium ergini bilen 90% (A) we 5% asetonitrilden (B) ybaratdy. Gradient programmasy aşakdaky ýalydy: 0–1.5 min, 0% B; 1.5–6.5 min, 0–15% B; 6.5–8 min, 15% B; 8–8.5 min, 15%–0% B; 8.5–11.5 min, 0%B. Awtosamplerde sütün 40 °C, nusga bolsa 10 °C temperaturada saklandy. Akym tizligi 0,3 ml/min, inýeksiýanyň möçberi bolsa 1 μL boldy. MS parametrleri aşakdaky ýaly sazlandy: kapillýar naprýaženiýe ±3,5 kV, nebulaýzer basyşy 35 psi, örtük gazynyň akymy 12 L/min, örtük gazynyň temperaturasy 350°C, guradyjy gazyň temperaturasy 250°C we guradyjy gazyň akymy 14 l/min. Triptofanyň, piruwatyň, laktatyň, gipoksantiniň we ksantiniň MRM konwersiýalary degişlilikde 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 we 151,0–107,9 boldy. Maglumatlar Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) ulanyp ýygnaldy. Syworotka nusgalary üçin triptofan, piruwat, laktat, gipoksantin we ksantin standart garyndy erginleriniň kalibrleme egrilerini ulanyp mukdary kesgitlendi. Öýjük nusgalary üçin triptofanyň mukdary içki standarta we öýjük belogynyň massasyna kadalaşdyryldy.
Iň ýokary ekstraksiýa (m/z we saklanma wagty (RT)) Compound Discovery 3.1 we TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) ulanylyp amala aşyryldy. Toparlaryň arasyndaky potensial tapawutlary aradan aýyrmak üçin, synag nusgasynyň her bir häsiýetli depesi deňeşdirme bolçulygyny almak üçin şol bir partiýadan alnan salgylanma materialynyň häsiýetli depesine bölündi. Standartlaşdyrmadan öň we soň içki standartlaryň deňeşdirme standart çetleşmeleri Goşmaça 6-njy tablisada görkezilen. Iki toparyň arasyndaky tapawutlar ýalňyş açyş tizligi (FDR<0.05, Wilcoxon golly dereje synagy) we gatlaşyk üýtgemegi (>1.2 ýa-da <0.83) bilen häsiýetlendirildi. Çykarylan aýratynlyklaryň çig MS maglumatlary we salgylanma syworotka bilen düzedilen MS maglumatlary degişlilikde Goşmaça 1-nji we Goşmaça 2-nji maglumatlarda görkezilen. Iň ýokary annotasiýa anyklanan metabolitler, çaklanylýan düşündirişli birleşmeler, çaklanylýan düşündirişli birleşme synplary we näbelli birleşmeler 22 ýaly dört kesgitlenen kesgitleme derejesine esaslanyp ýerine ýetirildi. Compound Discovery 3.1-de (mzCloud, HMDB, Chemspider) maglumatlar bazasyndaky gözleglere esaslanyp, tassyklanan standartlara laýyk gelýän MS/MS ýa-da mzCloud-da (bal > 85) ýa-da Chemspider-de takyk gabat gelýän annotasiýalary bolan biologik birleşmeler ahyrsoňy differensial metabolomyň arasyndaky aralyk hökmünde saýlandy. Her bir aýratynlyk üçin iň ýokary annotasiýalar Goşmaça Maglumatlar 3-de goşuldy. MetaboAnalyst 5.0 jemi normalaşdyrylan metabolitleriň köplüginiň bir üýtgeýän analizi üçin ulanyldy. MetaboAnalyst 5.0 şeýle hem KEGG ýolunyň baýlaşdyryş analizini düýpli tapawutly metabolitlere esaslanýan bahalandyrdy. Esasy komponent analizi (PCA) we bölekleýin iň kiçi kwadratlar diskriminant analizi (PLS-DA) ropls programma üpjünçiligi paketini (v.1.26.4) ulanyp, stek normallaşdyrmasy we awtomatik ölçekleme bilen analiz edildi. Düwünleriň howplylygyny çaklamak üçin optimal metabolit biomarker modeli iň kiçi absolýut kiçelme we saýlama operatory (LASSO, R paketi v.4.1-3) bolan binar logistik regressiýa arkaly döredildi. Diskriminant modeliň anyklaýyş we tassyklama toplumlaryndaky işi, pROC bukjasyna (v.1.18.0.) laýyklykda ROC analizine esaslanyp AUC bahalandyrmak arkaly häsiýetlendirildi. Optimal ähtimallyk çägi modeliň iň ýokary Ýuden indeksine (duýgurlyk + spesifiklik – 1) esaslanyp alyndy. Bosagadan az ýa-da ýokary gymmatlyklara eýe bolan nusgalar degişlilikde gowy däl düwünler we öýken adenokarsinomasy hökmünde çaklanylar.
A549 öýjükleri (#CCL-185, Amerikan görnüşli medeniýet kolleksiýasy) 10% FBS saklaýan F-12K gurşawynda ösdürilip ýetişdirildi. SLC7A5-i nyşana alýan gysga tüýli RNK (shRNA) yzygiderlikleri we nyşana almaýan gözegçilik (NC) lentiwirus wektor pLKO.1-puro girizildi. shSLC7A5-iň antisens yzygiderlikleri aşakdaky ýaly: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5-e (#5347) we tubuline (#2148) garşy antiteller Cell Signaling Technology-den satyn alyndy. Western blot analizi üçin SLC7A5-e we tubuline garşy antiteller 1:1000 suwuklandyrylanda ulanyldy.
Seahorse XF Glikolitik Stress Testi hüjre daşyndaky kislotalaşma (ECAR) derejesini ölçeýär. Synagda, ECAR arkaly ölçenýän hüjre glikolitik kuwwatyny barlamak üçin glýukoza, oligomisin A we 2-DG yzygiderli berildi.
Nyşana alynmaýan gözegçilik (NC) we shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bilen transfeksiýa edilen A549 öýjükleri 10 sm diametrli gaplarda bir gije goýuldy. Öýjük metabolitleri 1 ml buz ýaly sowuk 80% suwly metanol bilen ekstraksiýa edildi. Metanol erginindeki öýjükler gyrylyp alyndy, täze turba ýygnaldy we 15,000 × g-da 4°C-da 15 minutlap santrifuga edildi. 800 µl üstki suwy ýygnaň we ýokary tizlikli wakuum konsentratoryny ulanyp guradyň. Soňra guradylan metabolit granulalary ýokarda beýan edilişi ýaly LC-MS/MS ulanyp triptofan derejelerine seljerildi. A549 öýjüklerinde (NC we shSLC7A5) öýjük NAD(H) derejeleri öndürijiň görkezmelerine laýyklykda mukdary NAD+/NADH kolorimetrik toplumy (#K337, BioVision) ulanyp ölçeldi. Metabolitleriň mukdaryny kadalaşdyrmak üçin her nusga üçin belok derejesi ölçeldi.
Nusga ölçegini öňünden kesgitlemek üçin hiç hili statistik usullar ulanylmady. Biomarkerleri açmaga gönükdirilen öňki metabolomika barlaglary15,18 ölçegi kesgitlemek üçin ölçeg hökmünde kabul edildi we bu hasabatlar bilen deňeşdirilende, biziň nusgamyz ýeterlik boldy. Barlag kohortasyndan hiç bir nusga çykarylmady. Nyşana alynmadyk metabolomika barlaglary üçin syworotka nusgalary tötänleýin açyş toparyna (306 ýagdaý, 74.6%) we içki tassyklama toparyna (104 ýagdaý, 25.4%) bölündi. Şeýle hem, maksatly metabolomika barlaglary üçin açyş toplumyndan her topardan 70 ýagdaýy tötänleýin saýladyk. Barlagçylar LC-MS maglumatlaryny ýygnamak we seljermek wagtynda topara bölmekden saklandylar. Metabolomika maglumatlarynyň we öýjük tejribeleriniň statistik seljermeleri degişli Netijeler, Şekiller we Usullar bölümlerinde beýan edilýär. Öýjük triptofanynyň, NADT-nyň we glikolitik işjeňligiň mukdaryny kesgitlemek üç gezek garaşsyz ýagdaýda geçirildi we şol bir netijeler bilen geçirildi.
Okuw dizaýny barada has giňişleýin maglumat üçin şu makala bilen baglanyşykly Tebigy Portfolio Hasabatynyň Gysgaça mazmunyna serediň.
Çykarylan aýratynlyklaryň çig MS maglumatlary we salgylanma syworotkasynyň normallaşdyrylan MS maglumatlary degişlilikde Goşmaça Maglumatlar 1-de we Goşmaça Maglumatlar 2-de görkezilýär. Dürli aýratynlyklaryň iň ýokary bellikleri Goşmaça Maglumatlar 3-de görkezilýär. LUAD TCGA maglumatlar toplumyny https://portal.gdc.cancer.gov/ sahypasyndan göçürip alyp bolýar. Grafiki çyzmak üçin giriş maglumatlary çeşme maglumatlarynda berilýär. Çeşme maglumatlary bu makala üçin berilýär.
Milli öýken barlag topary we ş.m. Pes dozaly kompýuter tomografiýasy bilen öýken rak keselinden ölüm derejesini azaltmak. Demirgazyk Angliýa. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR we Prophet, PC Pes dozaly spiral görnüşli KT ulanyp öýken rak keseliniň skriningi: Milli öýken skrininginiň (NLST) netijeleri. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ we beýlekiler. Randomizirlenen synagda göwrümli KT barlagy arkaly öýken rak keselinden ölüm derejesini azaltmak. Demirgazyk Angliýa. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Ýerleşdirilen wagty: 2023-nji ýylyň 18-nji sentýabry