Hasaplanan tomografiýa (KT) bilen kesgitlenen öýken düwünleriniň diferensial diagnozy kliniki tejribede kyn mesele bolup galýar.Bu ýerde, sagdyn gözegçilikleri, oňat öýken düwünlerini we I öýken adenokarsinomyny öz içine alýan 480 serum nusgasynyň global metabolomasyny häsiýetlendirýäris.Adenokarsinomlar özboluşly metabolomiki profilleri görkezýär, oňat düwünler we sagdyn adamlar metabolomiki profillerde ýokary meňzeşlige eýe.Tapyndy toparynda (n = 306) oňat we zyýanly düwünleri tapawutlandyrmak üçin 27 metabolit toplumy kesgitlenildi.Içerki tassyklama (n = 104) we daşarky tassyklama (n = 111) toparlardaky diskriminasiýa modeliniň AUC degişlilikde 0.915 we 0.945 boldy.Wayol seljermesi, oňat düwünler we sagdyn gözegçilikler bilen deňeşdirilende, öýken adenokarsinoma seriýasyndaky triptofanyň peselmegi bilen baglanyşykly glikolitiki metabolitleriň köpelendigini ýüze çykardy we triptofanyň ýokaşmagy öýken rak öýjüklerinde glikolizi ýokarlandyrýandygyny öňe sürdi.Biziň gözlegimiz, KT tarapyndan ýüze çykarylan öýken düwünleriniň töwekgelçiligini bahalandyrmakda serum metabolit biomarkerleriniň ähmiýetini görkezýär.
Irki diagnoz, rak keselinden halas bolmak derejesini ýokarlandyrmak üçin möhümdir.ABŞ-nyň öýken rak keselini barlamak boýunça synag (NLST) we Europeanewropa NELSON gözleginiň netijesi, pes dozaly hasaplanan tomografiýa (LDCT) bilen barlag, ýokary töwekgelçilikli toparlarda öýken rak keseliniň ölümini ep-esli azaldyp biljekdigini görkezdi.LDCT öýken rakyny barlamak üçin giňden ulanylaly bäri, asimptomatiki öýken düwünleriniň tötänleýin radiografiki tapyndylary 4-e çenli artmagyny dowam etdirýär.Öýken düwünleri, diametri 5 sm çenli fokus açyklygy hökmünde kesgitlenilýär.Zeper ýetme ähtimallygyna baha bermekde we LDCT-de tötänleýin ýüze çykarylan köp sanly öýken düwünleri bilen iş salyşmakda kynçylyklar bilen ýüzbe-ýüz bolýarys.KT-nyň çäklendirmeleri ýygy-ýygydan yzarlanyş synaglaryna we ýalňyş polo positiveitel netijelere sebäp bolup biler, gereksiz gatyşmalara we çakdanaşa bejergä sebäp bolup biler6.Şonuň üçin irki döwürde öýken rakyny dogry kesgitlemek we 7-nji başlangyçda iň oňat düwünleri tapawutlandyrmak üçin ygtybarly we peýdaly biomarkerleri ösdürmeli.
Genomika, proteomika ýa-da DNK metilizasiýasy ýaly ganyň (serum, plazma, periferiýa gan mononukleer öýjükleri) toplumlaýyn molekulýar seljermesi öýken ragy üçin anyklaýyş biomarkerleriniň tapylmagyna gyzyklanmanyň artmagyna sebäp boldy.Bu aralykda, metabolomika çemeleşmeleri endogen we ekzogen hereketleriň täsiri bilen öýjükli ahyrky önümleri ölçäp, keseliň başlanmagyny we netijesini çaklamak üçin ulanylýar.Suwuk hromatografiýa-tandem köpçülik spektrometri (LC-MS), ýokary duýgurlygy we dürli dinamiki diapazony sebäpli metabolomikany öwrenmek üçin giňden ulanylýan usuldyr, dürli fiziki-himiki aýratynlyklary bolan metabolitleri örtüp bilýär11,12,13.Plazma / serumyň global metabolomiki derňewi öýken rak keselini anyklamak we bejerginiň netijeliligi bilen baglanyşykly biomarkerleri kesgitlemek üçin ulanylsa-da, oňat we zyýanly öýken düwünlerini tapawutlandyrmak üçin 18 serum metabolit klassifikatory entek öwrenilmeli.-Massive gözleg.
Adenokarsinoma we skamous öýjükli karsinoma, öýjükli däl öýken rakynyň (NSCLC) iki esasy görnüşidir.Dürli KT barlag synaglary adenokarsinomanyň öýken rakynyň iň köp ýaýran gistologiki görnüşidigini görkezýär1,19,20,21.Bu gözlegde, sagdyn gözegçilik, oňat öýken düwünleri we KT kesgitlenen ≤3 sm ýaly jemi 695 serum nusgasynda metabolomika derňewini geçirmek üçin ultra öndürijilikli suwuk hromatografiýa-ýokary çözgütli köpçülik spektrometri (UPLC-HRMS) ulandyk.I tapgyrda öýken adenokarsinomyny barlamak.Öýken adenokarsinomyny oňat düwünlerden we sagdyn gözegçiliklerden tapawutlandyrýan serum metabolitleriniň toparyny kesgitledik.Wayol baýlaşdyryş derňewi, adaty bolmadyk triptofanyň we glýukoza çalşygynyň öýken adenokarsinomasynda oňat düwünler we sagdyn gözegçilikler bilen deňeşdirilende umumy üýtgemelerdigini ýüze çykardy.Ahyrynda, LDCT tarapyndan ýüze çykarylan zyýanly we oňat öýken düwünlerini tapawutlandyrmak üçin ýokary aýratynlygy we duýgurlygy bilen serum metabolik klassifikatoryny döretdik we tassykladyk, bu irki diferensial diagnoz we töwekgelçiligi bahalandyrmaga kömek edip biler.
Häzirki gözlegde, 174 sagdyn gözegçilikden, oňat öýken düwünleri bilen 292 näsagdan we I öýken adenokarsinomasy bolan 229 näsagdan jyns we ýaşa laýyk gelýän serum nusgalary retrospektiv ýagdaýda ýygnaldy.695 dersiň demografiki aýratynlyklary 1-nji tablisada görkezilýär.
1a suratda görkezilişi ýaly, Gün atat-sen uniwersitetiniň rak kesel merkezinde 174 sagdyn gözegçilik (HC), 170 sany oňat düwün (BN) we 136-njy tapgyrda öýken adenokarsinoma (LA) nusgalary ýaly jemi 480 serum nusgasy ýygnaldy.Ultra öndürijilikli suwuk hromatografiýa-ýokary çözgütli köpçülik spektrometri (UPLC-HRMS) ulanyp, maksatly metabolomiki profil üçin açyş topary.Goşmaça 1-nji suratda görkezilişi ýaly, klassifikasiýa modelini döretmek we diferensial ýol derňewini has giňişleýin öwrenmek üçin LA we HC, LA we BN arasyndaky diferensial metabolitler kesgitlenildi.Sun atat-sen uniwersitetiniň rak kesel merkezi tarapyndan toplanan 104 nusga we beýleki iki hassahanada ýygnan 111 nusga degişlilikde içerki we daşarky tassyklamalara sezewar edildi.
Ultra öndürijilikli suwuk hromatografiýa-ýokary çözgütli köpçülik spektrometri (UPLC-HRMS) ulanyp, global serum metabolomikasynyň derňewini geçiren açyş toparyndaky ilat.b Sagdyn gözegçilik (HC, n = 174), oňat düwünler (BN, n = 170) we I basgançak adenokarsinoma ýaly gözleg toparyndaky 480 serum nusgasynyň umumy metabolomasynyň bölekleýin iň az kwadrat diskriminasiýa derňewi (PLS-DA). (Los An Angeleseles, n = 136).+ ESI, polo positiveitel elektrospraý ionlaşdyrma tertibi, -ESI, negatiw elektrospraý ionlaşdyrma tertibi.c - e Iki toparda ep-esli köp mukdarda metabolitler (iki guýrukly Wilkokson gol derejesi synagy, ýalňyş tapyş derejesi düzedilen p bahasy, FDR <0.05) gyzyl (ep-esli üýtgeşme> 1,2) we gök (bukjanyň üýtgemegi <0.83) görkezilýär .) wulkan grafikasynda görkezilýär.f LA we BN arasynda düşündirişli metabolitleriň sanynda düýpli tapawutlary görkezýän iýerarhiki toparlanyş ýylylyk kartasy.Çeşme maglumatlary çeşme faýllary görnüşinde berilýär.
Tapyndy toparyndaky 174 HC, 170 BN we 136 LA-nyň umumy serum metabolomy UPLC-HRMS derňewi arkaly derňeldi.Ilki bilen, häzirki gözlegiň durnuklylygyny tassyklaýan, gözegçilik edilmeýän esasy komponent seljermesi (PCA) modeliniň merkezinde hil gözegçiliginiň (QC) nusgalarynyň toplumyny berk görkezýäris (Goşmaça 2-nji surat).
Bölekleýin iň az kwadrat-diskriminasiýa derňewinde (PLS-DA) 1-nji suratda görkezilişi ýaly, LA we BN, LA we HC arasynda polo positiveitel (+ ESI) we otrisatel (−ESI) elektrospraý ionlaşdyrma reesimlerinde aç-açan tapawutlaryň bardygyny gördük. .izolirlenen.Şeýle-de bolsa, + ESI we -ESI şertlerinde BN bilen HC arasynda düýpli tapawut tapylmady.
LA bilen HC arasynda 382 diferensial aýratynlyk, LA we BN arasynda 231 diferensial aýratynlyk we BN bilen HC arasynda 95 diferensial aýratynlyk tapdyk (Wilkokson gol derejesi synagy, FDR <0.05 we köp üýtgeşiklik> 1.2 ýa-da <0.83) (Surat .1c-e )..Peakslar mundan beýläk (goşmaça maglumatlar 3) maglumatlar bazasyna (mzCloud / HMDB / Chemspider kitaphanasy) m / z bahasy, saklanyş wagty we bölek spektr gözlegi (Usullar bölüminde beýan edilen jikme-jiklikler) 22 bilen düşündirildi.Netijede, köp tapawutlylygy bolan 33 we 38 düşündirişli metabolitler degişlilikde LA garşy BN (1f surat we goşmaça tablisa 2) we LA garşy HC (goşmaça 3-nji surat we goşmaça tablisa 2) kesgitlenildi.Munuň tersine, BN we HC-de PLS-DA-da BN bilen HC-iň arasyndaky gabat gelişine laýyk gelýän köp tapawutly diňe 3 metabolit kesgitlenildi.Bu diferensial metabolitler köp biohimiki serişdeleri öz içine alýar (Goşmaça 4-nji surat).Bu netijeler bilelikde alynanda, öýken düwnükleriniň ýa-da sagdyn mowzuklar bilen deňeşdirilende irki döwürdäki öýken rakynyň ýaramaz üýtgemegini görkezýän serum metabolomasynda düýpli üýtgeşmeleri görkezýär.Bu aralykda, BN we HC serum metabolomasynyň meňzeşligi, oňat öýken düwünleriniň sagdyn adamlar bilen köp biologiki aýratynlyklary paýlaşyp biljekdigini görkezýär.Epidermal ösüş faktoryny kabul edijiniň (EGFR) gen mutasiýalarynyň öýken adenokarsinoma görnüşiniň 23-sinde köp bolýandygyny göz öňünde tutup, sürüjiniň mutasiýalarynyň serum metabolomasyna täsirini kesgitlemäge synanyşdyk.Soňra öýken adenokarsinoma toparyndaky EGFR ýagdaýy bolan 72 hadysanyň umumy metabolomiki profilini analiz etdik.Gyzykly tarapy, PCA derňewinde EGFR mutant hassalary (n = 41) we EGFR ýabany görnüşli hassalar (n = 31) arasynda deňeşdirip boljak profilleri tapdyk (Goşmaça 5a surat).Şeýle-de bolsa, ýabany görnüşli EGFR hassalary bilen deňeşdirilende EGFR mutasiýa bolan näsaglarda bollygy ep-esli üýtgän 7 metabolit kesgitledik (goşmaça synag 5b).Bu metabolitleriň köpüsi (7-den 5-si) ýag kislotasynyň okislenme ýollarynda möhüm rol oýnaýan asilkarnitinlerdir.
2-nji suratda görkezilen iş prosesinde görkezilişi ýaly, düwünleriň klassifikasiýasy üçin biomarkerler iň az mutlak gysyş operatorlary we LA (n = 136) we BN (n = 170) bilen kesgitlenen 33 diferensial metabolit esasynda saýlandy.Üýtgeýjileriň iň gowy kombinasiýasy (LASSO) - ikilik logistik regressiýa modeli.Modeliň ygtybarlylygyny barlamak üçin on esse kesişme ulanyldy.Üýtgeýjini saýlamak we parametrleri kadalaşdyrmak λ24 parametri bilen iň ýokary derejedäki jeza bilen sazlanýar.Global metabolomika derňewi, diskriminasiýa modeliniň klassifikasiýa işini barlamak üçin içerki tassyklama (n = 104) we daşarky tassyklama (n = 111) toparlarynda özbaşdak geçirildi.Netijede, açyş toplumyndaky 27 metabolit iň uly ortaça AUC bahasy (2-nji surat) bilen iň oňat diskriminasiýa modeli hökmünde kesgitlenildi, şolaryň 9-sy işjeňligi artdyrdy we LA-da işjeňligi 18 azaldy (2-nji surat).
On esse kesiş barlagy arkaly ikilik logistik regressiýa modelini ulanyp, açyş toplumynda serum metabolitleriniň iň gowy panelini saýlamak we içerki we daşarky tassyklama toplumlarynda çaklaýyş işine baha bermek ýaly öýken düwünleriniň klassifikatoryny döretmek üçin iş tertibi.b Metabolik biomarker saýlamak üçin LASSO regressiýa modeliniň kross-tassyklama statistikasy.Aboveokarda berlen sanlar, belli bir atda saýlanan biomarkerleriň ortaça sanyny görkezýär.Gyzyl punktir çyzyk, degişli lambda-da ortaça AUC bahasyny görkezýär.Çal reňkli barlar iň az we iň ýokary AUC bahalaryny görkezýär.Punktir çyzyk, saýlanan 27 biomarker bilen iň oňat modeli görkezýär.AUC, kabul edijiniň işleýiş häsiýetli (ROC) egriniň aşagyndaky meýdan.c LA toparyndaky 27 sany metabolitiň açyş toparyndaky BN topary bilen deňeşdirilende ep-esli üýtgemegi.Gyzyl sütün - işjeňleşdirme.Gök sütün peselýär.d - f açyşda, içerki we daşarky tassyklama toplumlarynda 27 metabolit kombinasiýasyna esaslanýan diskriminasiýa modeliniň güýjüni görkezýän kabul ediji işleýiş häsiýetli (ROC) egriler.Çeşme maglumatlary çeşme faýllary görnüşinde berilýär.
Bu 27 metabolitiň agramly regressiýa koeffisiýentlerine esaslanyp çaklama modeli döredildi (Goşmaça tablisa 3).Bu 27 metabolitiň esasynda ROK derňewi, egriniň (AUC) bahasy 0.933, açyş toparynyň duýgurlygy 0.868, aýratynlygy 0.859 (2d surat) boldy.Bu aralykda, LA we HC arasyndaky 38 düşündirişli diferensial metabolitleriň arasynda 16 metabolit toplumy 0.801 duýgurlygy we LA-ny HC-den tapawutlandyrmakda 0.856 aýratynlygy bilen 0.902 AUC gazandy (Goşmaça 6a-c).Differensial metabolitler üçin dürli eplenç çäklerine esaslanýan AUC bahalary hem deňeşdirildi.Klassifikasiýa modeliniň, ep-esli üýtgemegiň derejesi 1.5 ýa-da 2.0 bilen deňeşdirilende 1,2-e bellenende LA we BN (HC) arasynda tapawutlandyrmakda iň oňat netije alandygyny gördük (Goşmaça 7a, b).27 metabolit toparyna esaslanýan klassifikasiýa modeli içerki we daşarky koortlarda hasam tassyklandy.AUC içerki barlamak üçin 0.915 (duýgurlyk 0.867, aýratynlyk 0.811) we daşarky tassyklamak üçin 0.945 (duýgurlyk 0.810, aýratynlyk 0.979) boldy (2e surat, f).Bilelikdäki netijelilige baha bermek üçin, Usullar bölüminde beýan edilişi ýaly daşarky laboratoriýada 40 nusga seljerildi.Klassifikasiýa takyklygy 0.925 AUC gazandy (Goşmaça 8-nji surat).Öýken skamous öýjükli karsinoma (LUSC), öýken adenokarsinomasyndan (LUAD) soň kiçi öýjükli öýken rakynyň (NSCLC) ikinji köp ýaýran görnüşi bolany üçin, metabolik profilleriň tassyklanan peýdalylygyny hem synagdan geçirdik.BN we LUSC 16 hadysasy.LUSC bilen BN arasyndaky diskriminasiýa AUC 0.776 boldy (Goşmaça 9-njy surat), bu LUAD we BN arasyndaky diskriminasiýa bilen deňeşdirilende has pes ukyplylygy görkezýär.
Geçirilen gözlegler, KT şekillerindäki düwünleriň ululygynyň erbetlik ähtimallygy bilen oňyn arabaglanyşygyny we düwün bejergisiniň esasy kesgitleýjisi bolandygyny görkezdi 25,26,27.NELSON barlag barlagynyň uly toparyndan alnan maglumatlaryň seljermesi, <5 mm düwünli predmetlerde erbetlik töwekgelçiliginiň hatda 28 düwün bolmadyk derslerdäki ýalydygyny görkezdi.Şonuň üçin, KT yzygiderli gözegçiligini talap edýän iň pes ululyk, Iňlis Torak jemgyýetiniň (BTS) maslahat berşi ýaly 5 mm, Fleýşner jemgyýeti 29-nyň maslahat berşi ýaly 6 mm.Şeýle-de bolsa, 6 mm-den uly we kesgitlenmedik öýken düwünleri (IPN) diýilýän aç-açan hoşniýetli düwünler, kliniki tejribede baha bermekde we dolandyrmakda esasy kynçylyk bolup galýar30,31.Soňra, düwün ululygynyň açyşdan we içerki tassyklaýyş kohortlaryndan toplanan nusgalary ulanyp, metabolomiki gollara täsir edendigini ýa-da ýokdugyny gözden geçirdik.27 tassyklanan biomarkerlere ünsi jemläp, ilki bilen HC we BN sub-6 mm metabolomlaryň PCA profilini deňeşdirdik.HC we BN üçin maglumatlar nokatlarynyň köpüsiniň bir-birine gabat gelendigini, serumyň metabolit derejesiniň iki toparda-da meňzeşdigini görkezýäris (3a surat).Dürli ululykdaky aýratynlyk kartalary BN we LA-da saklandy (3b surat, c), 6–20 mm aralykda zyýanly we hoşniýetli düwünleriň arasynda bölünişik boldy (3d surat).Bu kohortda AUC 0.927, aýratynlygy 0.868, 6 - 20 mm ölçegdäki düwünleriň erbetligini çaklamak üçin 0.820 duýgurlygy bardy (3e surat, f).Netijelerimiz, klassifikatoryň düwün ululygyna garamazdan irki zyýanly üýtgemeler sebäpli ýüze çykýan metabolik üýtgeşmeleri ele alyp biljekdigini görkezýär.
mahabat 27 metabolitiň metabolik klassifikatoryna esaslanýan kesgitlenen toparlaryň arasynda PCA profillerini deňeşdirmek.CC we BN <6 mm.b BN <6 mm vs BN 6–20 mm.LA-da 6–20 mm, LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm we LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN <6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e 6–20 mm düwünler üçin tapawutly model öndürijiligini görkezýän kabul edijiniň işleýiş häsiýeti (ROC) egrisi.f abilityhtimallyk bahalary 6–20 mm ölçegli düwünler üçin logistik regressiýa modeline esaslanyp hasaplandy.Çal reňkli çyzyk iň amatly bahany görkezýär (0.455).Aboveokardaky sanlar Los-An Angeleselesde çak edilýän işleriň göterimini görkezýär.Iki guýrukly Talyp synagyny ulanyň.PCA, esasy komponent derňewi.Egriniň aşagyndaky AUC meýdançasy.Çeşme maglumatlary çeşme faýllary görnüşinde berilýär.
Mundan başga-da, öýken düwünleriniň ululygy (7–9 mm) bolan dört sany nusga (4–61 ýaş), göz öňünde tutulan malign çaklamasynyň modeliniň ýerine ýetirilişini görkezmek üçin saýlandy (4a surat, b).Ilkinji barlagda, 1-nji hadysa, kalsifikasiýa bilen berk düwün hökmünde görkezildi, hoşniýetlilik bilen baglanyşykly aýratynlyk, 2-nji hadysada bolsa belli bir gowy häsiýeti bolmadyk kesgitlenmedik bölekleýin berk düwün hökmünde görkezildi.Gözlegiň üç tapgyry, bu ýagdaýlaryň 4 ýylyň dowamynda durnukly bolandygyny we şonuň üçin hoşniýetli düwünler hasaplanýandygyny görkezdi (4a surat).KT seriýalarynyň kliniki bahalandyrmasy bilen deňeşdirilende, häzirki klassifikator modeli bilen bir gezeklik serum metabolit derňewi, ähtimallyk çäklendirmelerine esaslanýan bu oňat düwünleri çalt we dogry kesgitledi (1-nji tablisa).3b ýagdaýynda 4b suratda köplenç erbetlik bilen baglanyşykly pleýural yza çekiliş alamatlary bolan düwün görkezilýär32.4-nji hadysa, oňat sebäbini görkezmeýän kesgitlenmedik bölekleýin gaty düwün hökmünde görkezildi.Bu ýagdaýlaryň hemmesi klassifikator modeline görä zyýanly diýlip çaklanyldy (1-nji tablisa).Öýken adenokarsinomasyna baha bermek, öýken rezeksiýa operasiýasyndan soň gistopatologiki barlag arkaly görkezildi (4b-nji surat).Daşarky tassyklama toplumy üçin metabolik klassifikator 6 mm-den uly bolmadyk öýken düwünleriniň iki ýagdaýyny takyk çaklaýar (Goşmaça 10-njy surat).
Iki sany oňat düwünli öýkeniň eksenel penjiresiniň KT şekilleri.1-nji ýagdaýda, 4 ýyldan soň KT barlagy sag aşaky lobda kalsifikasiýa bilen 7 mm ölçegli durnukly düwün görkezdi.2-nji ýagdaýda, 5 ýyldan soň KT gözlemek sag ýokarky lobuň diametri 7 mm bolan durnukly, bölekleýin gaty düwün tapdy.b Öýkeniň eksenel penjiresi KT şekilleri we öýken rezeksiýasyndan öň adenokarsinoma I basgançagynyň iki ýagdaýynyň degişli patologiki gözlegleri.3-nji hadysada, sag ýokarky lobda pleýural yza çekilmegi bilen diametri 8 mm bolan düwün ýüze çykaryldy.4-nji hadysada çep ýokarky lobda 9 mm ölçegli bölekleýin gaty ýer aýna düwünleri ýüze çykaryldy.Gematoksilin we eozin (H&E) kesilen öýken dokumasynyň boýagy (şkalada bar = 50 μm) öýken adenokarsinomasynyň acinar ösüşini görkezýär.Oklar KT şekillerinde ýüze çykarylan düwünleri görkezýär.H&E şekilleri, patolog tarapyndan barlanan köp (> 3) mikroskopiki meýdanlaryň şekilli şekilleridir.
Netijelerimiz bilelikde alnanda, KT barlagyna baha berlende kynçylyk döredip biljek öýken düwünleriniň diferensial diagnozynda serum metabolit biomarkerleriniň potensial bahasyny görkezýär.
Barlanylan diferensial metabolit paneli esasynda esasy metabolik üýtgeşmeleriň biologiki baglanyşyklaryny kesgitlemäge synanyşdyk.MetaboAnalyst tarapyndan KEGG ýollaryny baýlaşdyrmak derňewi, iki toparyň arasynda ep-esli üýtgedilen 6 ýoly kesgitledi (LA vs. HC we LA vs. BN, sazlanan p ≤ 0,001, effekt> 0.01).Bu üýtgeşmeler piruwat alyş-çalşynyň, triptofanyň alyş-çalşynyň, niasin we nikotinamid çalşygynyň, glikoliziň, TCA sikliniň we purin çalşygynyň bozulmagy bilen häsiýetlendirildi (5a surat).Soňra mutlak mukdarda ulanyp, uly üýtgeşmeleri barlamak üçin maksatly metabolomikany ýerine ýetirdik.Adaty metabolit standartlaryny ulanyp, üçburçluk köpçülik spektrometri (QQQ) bilen köplenç üýtgedilen ýollarda umumy metabolitleri kesgitlemek.Metabolomikany öwrenmegiň maksat nusgasynyň demografiki aýratynlyklary Goşmaça tablisa 4-e girizildi. Global metabolomika netijelerimize laýyk gelýän mukdar taýdan derňew, gipoksantiniň we ksantiniň, piruwatyň we laktatyň LA-da BN we HC bilen deňeşdirilende köpelendigini tassyklady (5b, c, surat, p <0.05).Şeýle-de bolsa, BN bilen HC arasynda bu metabolitlerde düýpli tapawut tapylmady.
LA toparyndaky BN we HC toparlary bilen deňeşdirilende KEGG ýoluny baýlaşdyrmak derňewi.Iki guýrukly Globaltest ulanyldy we p bahalary Holm-Bonferroni usuly bilen sazlandy (p ≤ 0,001 we täsir ölçegi> 0.01).b - d LC-MS / MS tarapyndan kesgitlenýän HC, BN we LA seriýasynda gipoksantin, ksantin, laktat, piruwat we triptofan derejesini görkezýän skripka ýerleri.Ak we gara nokatly çyzyklar degişlilikde orta we dörtlügi görkezýär.e LUAD-TCGA maglumat bazasyndaky öýken adenokarsinomasynda (n = 513) SLC7A5 we QPRT kadalaşdyrylan Log2TPM (milliona ýazgy) mRNA görnüşini görkezýän skripka çyzgysy.Ak guty ikitaraplaýyn aralygy, merkezdäki keseligine gara çyzyk ortaça, gutudan uzalýan dik gara çyzyk bolsa 95% ynam aralygyny (CI) aňladýar.f SLC7A5-iň Pearson korrelýasiýa sýu ploteti we öýken adenokarsinomasynda (n = 513) we TCGA maglumat bazasyndaky adaty öýken dokumasynda (n = 59) GAPDH aňlatmasy.Çal reňk 95% CI-ni görkezýär.r, Pearson korrelýasiýa koeffisiýenti.g LC-MS / MS tarapyndan kesgitlenen belli bir shRNA dolandyryşy (NC) we shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bilen üýtgedilen A549 öýjüklerinde kadalaşdyrylan öýjükli triptofan derejesi.Her toparda bäş sany biologiki taýdan garaşsyz nusganyň statistik derňewi görkezilýär.h A549 öýjüklerinde (NC) we SLC7A5 A549 öýjüklerinde NADt (jemi NAD, şol sanda NAD + we NADH) öýjük derejeleri (Sh1, Sh2).Her toparda üç sany biologiki taýdan garaşsyz nusganyň statistik derňewi görkezilýär.i SLC7A5 urulmazyndan ozal we soň A549 öýjükleriniň glikolitiki işjeňligi, öýjükden daşary kislotalaşma derejesi (ECAR) bilen ölçeldi (her topara n = 4 biologiki taýdan garaşsyz nusga).2-DG, 2-deoksi-D-glýukoza.Iki guýrukly Talyp synagy (b - h) ulanyldy.(G - i) ýalňyşlyk setirleri ortaça ± SD-ni aňladýar, her synag üç gezek özbaşdak geçirildi we netijeler meňzeşdi.Çeşme maglumatlary çeşme faýllary görnüşinde berilýär.
LA toparyndaky üýtgedilen triptofan alyş-çalşynyň ep-esli täsirini göz öňünde tutup, QQQ ulanyp, HC, BN we LA toparlarynda serum triptofan derejesine baha berdik.LA-da serum triptofanynyň HC ýa-da BN (p <0,001, 5d surat) bilen deňeşdirilende azalandygyny gördük, bu gözegçilik toparynyň sagdyn gözegçiliklerine garanyňda öýken rak keselinde aýlanýan triptofanyň derejesiniň pesdigi baradaky öňki netijelere laýyk gelýär33,34 , 35.PET / CT yzarlaýjy 11C-metil-L-triptofany ulanmak bilen geçirilen başga bir gözleg, öýken rak dokumasynda triptofan signalynyň saklanyş wagtynyň oňat lezyonlar ýa-da adaty dokumalar bilen deňeşdirilende ep-esli ýokarlanandygyny ýüze çykardy36.LA seriýasyndaky triptofanyň peselmegi öýken rak öýjükleri tarapyndan işjeň triptofanyň ýokaşmagyny görkezip biler diýip çaklaýarys.
Triptofan katabolizminiň kynurenin ýolunyň ahyrky önüminiň glikolizde 1,3-bisfosfogliserat bilen gliseraldehid-3-fosfatyň reaksiýasy üçin möhüm substrat NAD + 37,38 bolandygy mälimdir.Öňki gözlegler, triptofan katabolizmasynyň immunitetiň kadalaşdyrylmagyna gönükdirilen bolsa-da, häzirki gözlegde synlanan triptofan tertipsizligi we glikolitiki ýollaryň arasyndaky özara baglanyşygy düşündirmäge synanyşdyk.Solute transporter maşgalasy 7 agza 5 (SLC7A5) triptofan daşaýjydygy belli, 43,44,45.Kwinolin kislotasy fosforibosiltransferaza (QPRT), kwinolin kislotasyny NAMN46-a öwürýän kynurenin ýolunyň aşaky akymynda ýerleşýän fermentdir.LUAD TCGA maglumat bazasynyň barlagy, SLC7A5 we QPRT ikisiniň hem adaty dokuma bilen deňeşdirilende çiş dokumasynda ep-esli tertipleşdirilendigini ýüze çykardy (5e surat).Bu ýokarlama I we II tapgyrlarda, şeýle hem öýken adenokarsinomasynyň III we IV tapgyrlarynda (Goşmaça 11-nji surat), tumorigenez bilen baglanyşykly triptofan çalşygynyň irki bozulmalaryny görkezýär.
Mundan başga-da, LUAD-TCGA maglumat toplumy, rak keseliniň nusgalarynda SLC7A5 bilen GAPDH mRNA aňlatmasynyň arasynda oňyn arabaglanyşygy görkezdi (r = 0.45, p = 1.55E-26, 5f surat).Munuň tersine, öýkeniň adaty dokumalarynda şeýle gen gollaryň arasynda düýpli baglanyşyk tapylmady (r = 0.25, p = 0.06, 5f surat).A549 öýjüklerindäki SLC7A5 (goşmaça 12-nji surat) öýjükli triptofan we NAD (H) derejesini ep-esli azaldy (5g surat, h), öýjükli kislotalaşma derejesi (ECAR) bilen ölçenen glikolitiki işjeňlige sebäp boldy (1-nji surat).5i).Şeýlelik bilen, serumdaky metabolik üýtgeşmelere we in vitro kesgitlemesine esaslanyp, triptofan alyş-çalşynyň kynurenin ýoly arkaly NAD + öndürip biljekdigini we öýken rakynda glikoliziň ösmeginde möhüm rol oýnap biljekdigini çaklaýarys.
Geçirilen gözlegler, LDCT tarapyndan ýüze çykarylan köp sanly kesgitlenmedik öýken düwünleriniň, PET-CT, öýken biopsiýasy we näsazlygyň ýalňyş polo positiveitel diagnozy sebäpli artykmaç synag edilmegine sebäp bolup biljekdigini görkezdi.31 6-njy suratda görkezilişi ýaly Biziň gözlegimiz, töwekgelçiligiň derejesini we KT tarapyndan ýüze çykarylan öýken düwünleriniň soňraky dolandyrylyşyny gowulandyryp biljek anyklaýyş gymmaty bolan serum metabolitleriniň toparyny kesgitledi.
Öpüş düwünleri pes dozaly hasaplanan tomografiýa (LDCT) arkaly oňat ýa-da zyýanly sebäpleri görkezýän şekillendiriş aýratynlyklary bilen bahalandyrylýar.Düwürtikleriň näbelliligi, yzygiderli yzarlamalara, gereksiz gatyşmalara we aşa aladalara sebäp bolup biler.Keseliň diagnostika gymmaty bolan serum metabolik klassifikatorlarynyň goşulmagy töwekgelçiligi bahalandyrmagy we öýken düwünleriniň soňraky dolandyrylyşyny gowulandyryp biler.PET pozitron zyňyndy tomografiýasy.
ABŞ-nyň NLST gözleginden we Europeanewropanyň NELSON gözleginden alnan maglumatlar, pes dozaly hasaplanan tomografiýa (LDCT) bilen ýokary töwekgelçilikli toparlary barlamak öýken rak keseliniň ölümini azaldyp biljekdigini görkezýär.Şeýle-de bolsa, LDCT tarapyndan ýüze çykarylan tötänleýin öýken düwünleriniň töwekgelçiligini bahalandyrmak we soňraky kliniki dolandyryş iň kyn mesele bolup galýar.Esasy maksat, ygtybarly biomarkerleri goşmak bilen bar bolan LDCT esasly protokollaryň dogry klassifikasiýasyny optimizirlemek.
Ganyň metabolitleri ýaly käbir molekulýar biomarkerler, öýken rakyny sagdyn gözegçilik bilen deňeşdirmek arkaly kesgitlenildi15,17.Häzirki gözlegde, LDCT tarapyndan tötänleýin ýüze çykarylan oňat we zyýanly öýken düwünlerini tapawutlandyrmak üçin serum metabolomikasynyň derňewini ulanmaga ünsi jemledik.UPLC-HRMS derňewi arkaly sagdyn gözegçilik (HC), oňat öýken düwünleri (BN) we I öýken adenokarsinoma (LA) nusgalarynyň global serum metabolomasyny deňeşdirdik.HC we BN-iň meňzeş metabolik profiliniň bardygyny gördük, LA bolsa HC we BN bilen deňeşdirilende möhüm üýtgeşmeleri görkezdi.LA-ny HC we BN-den tapawutlandyrýan serum metabolitleriniň iki toplumyny kesgitledik.
Gowy we zyýanly düwünler üçin häzirki LDCT esasly kesgitlemek shemasy, esasan, wagtyň geçmegi bilen düwünleriň ululygyna, dykyzlygyna, morfologiýasyna we ösüş depginine esaslanýar30.Öňki barlaglar düwünleriň ululygynyň öýken düwnük ähtimallygy bilen ýakyndan baglanyşyklydygyny görkezdi.Riskokary töwekgelçilikli hassalarda-da <6 mm düwünlerde näsazlyk töwekgelçiligi <1%.6-dan 20 mm aralygyndaky düwünler üçin näsazlyk töwekgelçiligi 8% -den 64% 30 aralygyndadyr.Şonuň üçin Fleýşner jemgyýeti KT-ni yzygiderli yzarlamak üçin 6 mm diametri kesmegi maslahat berýär.29 Şeýle-de bolsa, 6 mm-den uly bolmadyk kesgitlenmedik öýken düwünleriniň (IPN) töwekgelçiligini bahalandyrmak we dolandyrmak ýeterlik derejede ýerine ýetirilmedi.Dogabitdi ýürek keselini häzirki dolandyrmak, köplenç KT gözegçiligi bilen seresaply garaşmaga esaslanýar.
Barlanylan metabolomanyň esasynda sagdyn adamlar bilen hoşniýetli düwünleriň arasyndaky metabolomiki gollaryň ilkinji gezek gabat gelýändigini görkezdik <6 mm.Biologiki meňzeşlik, düwünler üçin näsazlyk töwekgelçiliginiň <6 mm düwünleri bolmadyk subýektler ýaly pesdigi baradaky öňki KT netijelerine laýyk gelýär. 30 Netijelerimiziň hem oňat düwünleriň <6 mm we ≥6 mm ýokarydygyny görkezýändigini bellemelidiris. metabolomiki profillerdäki meňzeşlik, oňat etiologiýanyň funksional kesgitlemesiniň düwün ululygyna garamazdan yzygiderlidigini görkezýär.Şeýlelik bilen, häzirki zaman diagnostika serum metabolit panelleri, düwünler ilkibaşda KT-de ýüze çykarylanda we yzygiderli gözegçiligi azaldyp bilse, kadadan çykma synagy hökmünde ýekeje analiz berip biler.Şol bir wagtyň özünde, metabolik biomarkerleriň şol bir topary ≥6 mm ululykdaky zyýanly düwünleri oňat düwünlerden tapawutlandyrdy we KT suratlarynda meňzeş ululykdaky IPN-ler we takyk morfologiki aýratynlyklar üçin takyk çaklamalar berdi.Bu zardyň alyş-çalyş klassifikatory, AUC 0.927 bilen ≥6 mm düwünleriň erbetligini çaklamakda gowy ýerine ýetirdi.Netijelerimiz bilelikde alnanda, täsin serum metabolomiki gollarynyň irki çiş bilen ýüze çykýan metabolik üýtgemeleri aýratyn görkezip biljekdigini we düwün ululygyna bagly bolmazdan töwekgelçiligi çaklaýjy hökmünde potensial ähmiýetiniň bardygyny görkezýär.
Ablyeri gelende aýtsak, öýken adenokarsinoma (LUAD) we öýjükli karsinoma (LUSC) kiçi öýjükli öýken rakynyň (NSCLC) esasy görnüşleridir.LUSC-iň temmäki ulanmagy bilen berk baglanyşyklydygyny we LUAD-yň KT barlagynda ýüze çykarylan tötänleýin öýken düwünleriniň iň köp ýaýran gistologiýasydygyny göz öňünde tutup, klassifikator modelimiz I adenokarsinoma nusgalary üçin ýörite guruldy.Wang we kärdeşleri LUAD-a ünsi jemlediler we irki döwürdäki öýken rakyny sagdyn adamlardan tapawutlandyrmak üçin lipidomikany ulanyp dokuz lipid goluny kesgitlediler17.Häzirki klassifikator modelini I LUSC we 74 hoşniýetli düwünleriň 16 ýagdaýynda synag etdik we LUAD bilen LUSC-iň öz metabolomiki gollarynyň bolup biljekdigini görkezip, pes LUSC çaklama takyklygyny (AUC 0.776) synladyk.Hakykatdanam, LUAD we LUSC etiologiýa, biologiki gelip çykyşy we genetiki kynçylyklar bilen tapawutlanýandyklary görkezildi49.Şonuň üçin gistologiýanyň beýleki görnüşleri barlag programmalarynda öýken rakyny ilat arasynda kesgitlemek üçin okuw modellerine girizilmelidir.
Bu ýerde, sagdyn gözegçilikler we hoşniýetli düwünler bilen deňeşdirilende, öýken adenokarsinomasynda iň ýygy-ýygydan üýtgedilen alty ýoly kesgitledik.Ksantin we gipoksantin, purin metabolik ýolunyň umumy metabolitleridir.Netijelerimize laýyk gelýän, purin metabolizmi bilen baglanyşykly araçylar, öýken adenokarsinomasy bolan näsaglaryň zardynda ýa-da dokumalarynda sagdyn gözegçilikler ýa-da öňüni alyş döwründe näsaglar bilen deňeşdirilende ep-esli ýokarlandy15,50.Zardyň ksantiniň we gipoksantiniň derejesiniň ýokarlanmagy, düwnük öýjükleriniň çalt köpelmegi üçin zerur bolan anabolizmi görkezip biler.Glyukoza çalşygyny tertipleşdirmek, rak keseliniň alyş-çalşynyň belli alamatydyr.Bu ýerde, LA toparyndaky piruwat we laktatyň HC we BN topary bilen deňeşdirilende ep-esli artandygyny gördük, bu öýjükli öýken ragy (NSCLC) hassalarynyň serum metabolome profillerinde glikolitiki ýollaryň näsazlyklary baradaky öňki habarlara laýyk gelýär we sagdyn gözegçilikler.netijeler yzygiderli 52,53.
Möhümi, öýken adenokarsinomlarynyň zardynda piruwat bilen triptofan alyş-çalşynyň arasyndaky ters arabaglanyşygy gördük.LA toparynda HC ýa-da BN topary bilen deňeşdirilende serum triptofan derejesi peseldi.Gyzykly tarapy, geljegi uly bolan bir topary ulanyp, ozalky uly göwrümli gözlegde, aýlanylýan triptofanyň pes derejesiniň öýken rak keseliniň ýokarlanmagy bilen baglanyşyklydygy anyklandy.Triptofan, iýmitden alýan möhüm aminokislotadyr.Öýken adenokarsinomynda serum triptofanyň azalmagy bu metabolitiň çalt azalmagyny görkezip biler diýen netijä gelýäris.Kynurenin ýoly arkaly triptofan katabolizmasynyň ahyrky önüminiň de-nowo NAD + sinteziniň çeşmesi bolup durýandygy mälimdir.NAD + esasan halas ediş ýoly arkaly öndürilýändigi sebäpli, NAD + -yň triptofan alyş-çalşynda saglyk we kesellerdäki ähmiýeti kesgitlenmeli 46.TCGA maglumatlar bazasyny seljerişimiz, öýken adenokarsinomasynda triptofan daşaýjy 7A5 (SLC7A5) aňlatmasynyň adaty gözegçilikler bilen deňeşdirilende ep-esli ýokarlanandygyny we glikolitiki ferment GAPDH bilen oňyn arabaglanyşygyny görkezdi.Öňki gözlegler esasan triptofan katabolizminiň antitora garşy immunitetini basyp ýatyrmakdaky roluna gönükdirilipdi40,41,42.Bu ýerde, öýken rak öýjüklerinde SLC7A5 urulmagy bilen triptofanyň ýokaşmagynyň öýjükli NAD derejesiniň soňraky peselmegine we glikolitiki işjeňligiň birleşmegine sebäp bolýandygyny görkezýäris.Gysgaça aýdanymyzda, gözlegimiz öýken adenokarsinomasynyň zyýanly üýtgemegi bilen baglanyşykly serum çalşygynyň üýtgemegi üçin biologiki esas berýär.
EGFR mutasiýa, NSCLC hassalarynda iň köp ýaýran sürüjiniň mutasiýa.Geçirilen işimizde, EGFR mutasiýa (n = 41) näsaglaryň, ýabany görnüşli EGFR (n = 31) näsaglara meňzeş umumy metabolomiki profiliniň bardygyny anykladyk, emma asilkarnitin hassalarynda käbir EGFR mutant hassalarynyň serum derejesiniň peselendigini gördük.Asilkarnitinleriň kesgitlenen wezipesi, sitoplazmadan mitokondrial matrisa asil toparlaryny daşamakdyr, bu bolsa 55 energiýa öndürmek üçin ýag kislotalarynyň okislenmegine getirýär.Gözleglerimiz bilen yzygiderli geçirilen soňky gözleg, öýken adenokarsinoma dokumasynyň 102 nusgasynyň global metabolomasyny seljermek arkaly EGFR mutant we EGFR ýabany görnüşli çişleriň arasyndaky meňzeş metabolom profilini kesgitledi.Gyzykly tarapy, EGFR mutant toparynda asilkarnitiniň düzümi hem tapyldy.Şol sebäpden, asilkarnitiniň derejesindäki üýtgeşmeler EGFR bilen ýüze çykýan metabolik üýtgemeleri görkezýärmi ýa-da esasy molekulýar ýollary mundan beýläk öwrenilmelidir.
Sözümiziň ahyrynda, gözlegimiz, öýken düwünleriniň diferensial diagnozy üçin serum metabolik klassifikatoryny döredýär we töwekgelçiligi bahalandyrmagy optimallaşdyryp we KT barlagynyň esasynda kliniki dolandyryşy ýeňilleşdirip biljek iş prosesini teklip edýär.
Bu gözleg, Sun atat-sen uniwersitetiniň rak keselhanasynyň etika komiteti, Gün atat-sen uniwersitetiniň ilkinji dahylly hassahanasy we Zhengzhou uniwersitetiniň rak keselhanasynyň etika komiteti tarapyndan tassyklandy.Tapyndy we içerki barlag toparlarynda, Düwnük keseliniň öňüni alyş we öňüni alyş bölüminde, Gün atat-sen uniwersitetiniň rak kesel merkezinde her ýyl lukmançylyk barlagyndan geçýän adamlardan sagdyn adamlardan 174 sera we oňat düwünlerden 244 sera ýygnaldy.serum.I etap öýken adenokarsinomlary Gün atat-sen uniwersitetiniň rak kesel merkezinden ýygnaldy.Daşarky barlag toparynda oňat düwünleriň 48, Gün atat-sen uniwersitetiniň ilkinji şahamçasyndan öýken adenokarsinomynyň 39, Çengjou rak keselhanasynyň öýken adenokarsinomasynyň 24 hadysasy boldy.Gün atat-sen uniwersitetiniň rak kesel merkezi, döredilen metabolik klassifikatoryň anyklaýyş ukybyny barlamak üçin I öýjükli öýjükli öýken rakynyň 16 hadysasyny ýygnady (goşmaça 5-nji tablisada görkezilýär).Tapyndy kohortyndan we içerki barlag toparyndan nusgalar 2018-nji ýylyň ýanwar aýyndan 2020-nji ýylyň maý aýyna çenli ýygnaldy. Daşarky tassyklama kohorty üçin nusgalar 2021-nji ýylyň awgustyndan 2022-nji ýylyň oktýabr aýyna çenli ýygnaldy. kohort.Tapyndy topary we içerki syn topary.Gatnaşanlaryň jynsy, öz-özüne hasabat bermek esasynda kesgitlenildi.Gatnaşanlaryň hemmesinden habarly razylyk alyndy we hiç hili kompensasiýa berilmedi.Gowy düwünli mowzuklar, derňew wagtynda 2 ýyldan 5 ýyla çenli durnukly KT barlagy bolanlardy, deslapky ýygnalan we gistopatologiýa diagnozy bolan daşarky tassyklama nusgasyndan 1 hadysadan başga.Dowamly bronhitden başga.Öýken adenokarsinoma keselleri öýken rezeksiýasyndan öň ýygnalyp, patologiki diagnoz bilen tassyklandy.Oraza tutýan gan nusgalary hiç hili antikoagulantsyz serum bölüji turbalarda ýygnaldy.Ganyň nusgalary otag temperaturasynda 1 sagat ýygnalyp, 2851 × g derejesinde 4 minutda 10 minutlap merkezden gaçyryldy.Serum alikotlary metabolit çykarylýança -80 ° C-de doňdy.Düwnük keseliniň öňüni almak we Gün atat-sen uniwersitetiniň rak kesel merkeziniň lukmançylyk barlagy bölümi, 40 ýaşdan 55 ýaş aralygyndaky erkekleriň we aýallaryň sanyny öz içine alýan 100 sagdyn donordan serum howuzyny ýygnady.Her donor nusgasynyň deň mukdary garyndy, emele gelen howuz -80 ° C derejesinde saklandy.Zardyň garyndysy hil gözegçiligi we maglumatlary standartlaşdyrmak üçin material hökmünde ulanyldy.
Salgy serumu we synag nusgalary eritildi we birleşdirilen gazyp almak usuly (MTBE / metanol / suw) 56 bilen metabolitler alyndy.Gysgaça aýdanyňda, 50 μl serum 225 μl buz sowuk metanol we 750 μl buz sowuk metil tert-butil efir (MTBE) bilen garyndy.Garyndyny garmaly we 1 sagat buzda saklamaly.Soňra nusgalar garyndy we içki ülňüleri öz içine alýan 188 μl MS derejeli suw bilen garyldy (13C-laktat, 13C3-piruwat, 13C-metionin we 13C6-izolýusin, Kembrij izotop barlaghanalaryndan satyn alyndy).Soňra garyndy 4 ° C-de 10 minut üçin 15,000 × g merkezden gaçyryldy we aşaky faza polo positiveitel we otrisatel usullarda LC-MS derňewi üçin iki turba (hersi 125 μL) geçirildi.Ahyrynda, nusga ýokary tizlikli wakuum konsentratorynda guraklyga öwrüldi.
Guradylan metabolitler 80% asetonitriliň 120 inlinde gaýtadan dikeldildi, 5 minut worteksirlendi we 4 ° C-de 10 minut üçin 15,000 × g merkezden gaçyryldy.Adatdan daşary jandarlar metabolomika gözlegleri üçin mikroinsertler bilen amber aýna flakonlara geçirildi.Ultra öndürijilikli suwuk hromatografiýa-ýokary çözgütli köpçülik spektrometri (UPLC-HRMS) platformasynda meýilleşdirilmedik metabolomika derňewi.Metabolitler “Dionex Ultimate 3000 UPLC” ulgamy we “ACQUITY BEH Amide” sütüni (2.1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) arkaly bölünipdi.Oňyn ion re modeiminde göçme fazalar 95% (A) we 50% asetonitril (B) bolup, hersinde 10 mmol / L ammiak asetat we 0,1% formik kislotasy bar.Negativearamaz tertipde, A we B ykjam fazalarda degişlilikde 95% we 50% asetonitril bar, iki fazada 10 mmol / L ammiak asetat, pH = 9. Gradient programmasy aşakdaky ýaly boldy: 0–0.5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14-16 minut, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1–20 min, 2% B. Sütün 40 ° C, nusga bolsa awtosamplerde 10 ° C derejesinde saklandy.Akym tizligi 0,3 ml / min, sanjym mukdary 3 μl.Elektrospraý ionlaşdyrma (ESI) çeşmesi bolan Q-Exactive Orbitrap köpçülik spektrometri (Termo Fisher Scientific) doly skaner re modeiminde işledi we köp mukdarda maglumat ýygnamak üçin ddMS2 gözegçilik tertibi bilen birleşdirildi.MS parametrleri aşakdaky ýaly kesgitlendi: pürküji naprýa + eniýe +3,8 kV / - 3,2 kV, kapilýar temperaturasy 320 ° C, gorag gazy 40 arb, kömekçi gaz 10 arb, gyzdyryjy ýylylyk temperaturasy 350 ° C, skaner aralygy 70-1050 m / sag, çözgüdi.70 000. Maglumatlar Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) ulanyp alyndy.
Maglumatlaryň hiline baha bermek üçin, her bir nusgadan adatdan daşary tebigatyň 10 μL alikotlaryny aýyrmak arkaly birleşdirilen hil gözegçiligi (QC) nusgalary döredildi.UPLC-MS ulgamynyň durnuklylygyna baha bermek üçin analitiki yzygiderliligiň başynda alty sany hil gözegçilik nusgasy sanjym edildi.Hil gözegçiligi nusgalary soňra wagtal-wagtal topara girizilýär.Bu gözlegde 11 partiýa serum nusgalarynyň hemmesi LC-MS tarapyndan seljerildi.100 sagdyn donordan serum howuzynyň garyndysy, çykaryş prosesine gözegçilik etmek we partiýa-partiýa effektlerini sazlamak üçin degişli toparlarda maglumat materialy hökmünde ulanyldy.Gün atat-sen uniwersitetiniň Metabolomika merkezinde açyş kohortynyň, içerki tassyklama kohortynyň we daşarky tassyklama kohortynyň maksatly metabolomika derňewi geçirildi.Guangdong Tehnologiýa Uniwersitetiniň Analiz we Synag Merkeziniň daşarky barlaghanasy, klassifikator modeliniň işleýşini barlamak üçin daşarky koortdan 40 nusga analiz etdi.
Gazyp almakdan we täzeden gurmakdan soň, köp reaksiýa gözegçilik (MRM) re iniminde elektrospraý ionlaşdyrma (ESI) çeşmesi bilen ultra ýokary öndürijilikli suwuk hromatografiýa-tandem köpçülik spektrometri (Agilent 6495 üçburçluk) bilen ölçenildi.ACQUITY BEH Amid sütüni (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, suwlar) metabolitleri bölmek üçin ulanyldy.Göçme faza 90% (A) we 5% asetonitril (B) 10 mmol / L ammiak asetat we 0,1% ammiak ergininden ybaratdy.Gradient programmasy şeýle boldy: 0–1.5 min, 0% B;1.5–6.5 min, 0-15% B;6.5–8 min, 15% B;8–8.5 min, 15% –0% B;8.5–11.5 min, 0% B.Sütün 40 ° C, nusga bolsa awtosamplerde 10 ° C derejesinde saklandy.Akym tizligi 0,3 ml / min, sanjym mukdary 1 μL boldy.MS parametrleri aşakdaky ýaly kesgitlenildi: kapilýar naprýa .eniýe ± 3,5 kV, nebulizator basyşy 35 psi, gabyň gaz akymy 12 L / min, gabyň gaz temperaturasy 350 ° C, guradyjy gazyň temperaturasy 250 ° C we guradyjy gaz akymy 14 l / min.Triptofan, piruwat, laktat, gipoksantin we ksantiniň MRM öwrülişikleri 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 we 151.0-107 boldy.Degişlilikde 9.Maglumatlar Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) ulanyp ýygnaldy.Zardyň nusgalary üçin triptofan, piruwat, laktat, gipoksantin we ksantin adaty garyndy erginleriniň kalibrleme egrileri bilen mukdarda kesgitlenildi.Öýjük nusgalary üçin triptofanyň düzümi içerki standart we öýjük belok massasyna kadalaşdyryldy.
Iň ýokary çykarmak (m / z we saklamak wagty (RT)) “Compound Discovery 3.1” we “TraceFinder 4.0” (Thermo Fisher Scientific) ulanylyp ýerine ýetirildi.Toparlaryň arasyndaky potensial tapawutlary aradan aýyrmak üçin synag nusgasynyň her bir häsiýetli derejesi, deňeşdirilen bollygy almak üçin şol bir topardan salgylanma materialynyň häsiýetli iň ýokary derejesine bölünýär.Içerki ülňüleriň standartlaşdyrylmazyndan ozal we soňraky standart gyşarmalary Goşmaça 6-njy tablisada görkezilýär. Iki toparyň arasyndaky tapawutlar ýalňyş açyş tizligi (FDR <0.05, Wilkokson gol derejesi synagy) we ep-esli üýtgemegi (> 1.2 ýa-da <0.83) bilen häsiýetlendirildi.Çykarylan aýratynlyklaryň çig MS maglumatlary we serumu düzedilen MS maglumatlary degişlilikde Goşmaça maglumatlar 1 we goşmaça maglumatlar 2-de görkezilýär.Iň ýokary düşündiriş, kesgitlenen metabolitleri, kesgitli düşündirişli birleşmeleri, putatiw häsiýetli birleşme synplaryny we näbelli birleşmeleri öz içine alýan dört kesgitlenen kesgitleme derejesine esaslanyp ýerine ýetirildi.“Compound Discovery 3.1” (mzCloud, HMDB, Chemspider) maglumat bazasynyň gözleglerine esaslanyp, tassyklanan standartlara laýyk gelýän biologiki birleşmeler ýa-da mzCloud (bal> 85) ýa-da Chemspider-de takyk gabat gelýän bellikler diferensial metabolomanyň arasynda araçy hökmünde saýlandy.Her aýratynlyk üçin iň ýokary bellikler goşmaça maglumatlara girýär. MetaboAnalyst 5.0, umumylaşdyrylan metabolit bolçulygyny birmeňzeş seljermek üçin ulanyldy.MetaboAnalyst 5.0, şeýle hem, dürli metabolitlere esaslanýan KEGG ýoluny baýlaşdyryş derňewine baha berdi.Esasy komponent derňewi (PCA) we bölekleýin iň az kwadrat diskriminasiýa derňewi (PLS-DA), stack normalizasiýa we awtoskalizasiýa bilen ropls programma üpjünçiligi bukjasy (v.1.26.4) ulanylyp seljerildi.Düwürtik keselini çaklamak üçin iň amatly metabolit biomarker modeli, iň az mutlak gysyş we saýlama operatory bilen ikilik logistik regressiýa arkaly döredildi (LASSO, R paket v.4.1-3).Diskriminasiýa modeliniň ýüze çykaryş we tassyklama toplumlarynda öndürijiligi, pROC paketine (v.1.18.0) laýyklykda ROK derňewi esasynda AUC-a baha bermek bilen häsiýetlendirildi.Iň amatly ähtimallyk kesilmegi, modeliň iň ýokary Youden indeksine (duýgurlyk + aýratynlyk - 1) esaslanýar.Bosagadan az ýa-da uly bahalary bolan nusgalar degişlilikde hoşniýetli düwünler we öýken adenokarsinoma diýlip çaklanylýar.
A549 öýjükleri (# CCL-185, Amerikan görnüşiniň medeni ýygyndysy) 10% FBS bolan F-12K gurşawynda ösdürilip ýetişdirildi.SLC7A5 nyşana alýan gysga saçly RNK (shRNA) yzygiderliligi we üýtgemeýän gözegçilik (NC) merkezi wektor pLKO.1-puro goýuldy.ShSLC7A5-iň antisense yzygiderliligi aşakdakylar: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3 ′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3 ′).Öýjük signalizasiýa tehnologiýasyndan SLC7A5 (# 5347) we tubuline (# 2148) antikorlar satyn alyndy.SLC7A5 we tubuline garşy antikorlar, Günbatar blot derňewi üçin 1: 1000 eritmede ulanyldy.
Seahorse XF glikolitiki stres synagy öýjükden daşary kislotalaşma (ECAR) derejesini ölçýär.Derňewde, glýukoza, oligomisin A we 2-DG, ECAR bilen ölçelişi ýaly öýjükli glikolitiki kuwwatyny barlamak üçin yzygiderli berildi.
Maksatsyz gözegçilik (NC) we shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bilen üýtgedilen A549 öýjükleri bir gije 10 sm diametrli gaplarda örtüldi.Öýjük metabolitleri 1 ml buz sowuk 80% suwly metanol bilen alyndy.Metanol erginindäki öýjükler gyryldy, täze turba ýygnandy we 4 ° C-de 15 minut üçin 15,000 × g merkezden gaçyryldy.Speedokary tizlikli wakuum konsentratoryny ulanyp, 800 µl adatdan daşary we gury ýygnaň.Guradylan metabolit bölejikleri, ýokarda görkezilişi ýaly LC-MS / MS ulanyp, triptofan derejesi üçin derňeldi.A549 öýjüklerinde (NC we shSLC7A5) öýjükli NAD (H) derejeleri öndürijiniň görkezmesine laýyklykda mukdarda NAD + / NADH kolorimetriki toplum (# K337, BioVision) bilen ölçenildi.Metabolitleriň mukdaryny kadalaşdyrmak üçin her nusga üçin belok derejesi ölçenildi.
Mysal ölçegini deslapky kesgitlemek üçin hiç bir statistik usul ulanylmady.Biomarkeriň açylyşyna gönükdirilen öňki metabolomika gözlegleri 15,18 ululygy kesgitlemek üçin görkeziji hasaplandy we bu hasabatlar bilen deňeşdirilende, mysalymyz ýeterlikdi.Gözleg toparyndan hiç hili nusga alynmady.Serum nusgalary tötänleýin açyş toparyna (306 hadysa, 74,6%) we maksatly metabolomika gözlegleri üçin içerki barlag toparyna (104 hadysa, 25,4%) berildi.Şeýle hem, maksatly metabolomika gözlegleri üçin açyş toplumyndan her topardan 70 hadysany tötänleýin saýladyk.Derňewçiler LC-MS maglumatlary ýygnamak we derňemek wagtynda toparlaýyn tabşyryklara göz ýumdular.Metabolomika maglumatlarynyň we öýjük synaglarynyň statistik derňewleri degişli netijeler, şekil rowaýatlary we usuly bölümlerinde beýan edilýär.Öýjükli triptofanyň, NADT we glikolitiki işjeňligiň mukdary birmeňzeş netijeler bilen üç gezek özbaşdak geçirildi.
Okuw dizaýny barada has giňişleýin maglumat üçin bu makala bilen baglanyşykly Tebigy Portfolio Hasabatynyň Abstraktyna serediň.
Çykarylan aýratynlyklaryň çig MS maglumatlary we salgylanma serumynyň kadalaşdyrylan MS maglumatlary degişlilikde Goşmaça maglumatlar 1 we goşmaça maglumatlar 2-de görkezilýär.Differensial aýratynlyklar üçin iň ýokary bellikler Goşmaça maglumatlar 3-de görkezilýär. LUAD TCGA maglumat toplumyny https://portal.gdc.cancer.gov/ salgysyndan göçürip alyp bilersiňiz.Grafany meýilleşdirmek üçin giriş maglumatlary çeşme maglumatlarynda berilýär.Bu makala üçin çeşme maglumatlary berilýär.
Milli öýken barlagy topary we ş.m. Az dozaly hasaplanan tomografiýa bilen öýken rak keseliniň ölümini azaltmak.Demirgazyk Angliýa.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR we Pygamber, pes dozaly dik CT ulanyp, öýken rak keselini barlamak: öýkeniň milli barlagynyň (NLST) netijeleri.J. Med.Ekran 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ we ş.m.Tötänleýin synagda göwrümli KT barlagy bilen öýken rakynyň ölümini azaltmak.Demirgazyk Angliýa.J. Med.382, 503-513 (2020).
Iş wagty: 18-2023-nji sentýabr